郎 平，陈宏伟，姜 云，罗慧丽，赵爱云，张秀萍*，齐 萌*

(1.塔里木大学动物科学学院/兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300； 2.新疆生产建设兵团第二师畜牧兽医工作站，新疆铁门关 841023)

嗜血支原体病和泰勒虫病均可引起牛高热、贫血、黄疸和消瘦等临床症状，导致牛生长发育迟缓、产奶量和生产性能降低，给养牛业造成一定的经济损失。已报道感染牛的嗜血支原体主要有温氏支原体(Mycoplasmawenyonii)和牛嗜血支原体待定种(CandidatusMycoplasmahaemobos)[1]；泰勒虫主要有环形泰勒虫(Theileriaannulata)、瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti)和中华泰勒虫(Theileriasinensis)[2]。在波斯尼亚和黑塞哥维那2例牛巴贝斯虫病例中，1头发病牛体表收集到8只蜱，用PCR法在其2份DNA样本中均检测出分歧巴贝斯虫(Babesiadivergens)，8份DNA样本中均检测出M.wenyonii，发现蜱可携带M.wenyonii[3]。为了解铁门关市散养奶牛嗜血支原体和泰勒虫感染情况，用PCR检测该市3个镇散养奶牛血液DNA样本并进行种类鉴定，以期为新疆地区奶牛血液性疾病的防治提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血样采集 2020年9月至12月，在铁门关市双丰镇、天湖镇和河畔镇随机选取1岁～2岁奶牛85头，用EDTA抗凝管经颈静脉采集血样3 mL～5 mL，依次编号后置放有冰袋的泡沫箱内带回实验室，4℃冷藏保存，72 h内提取DNA。

1.1.2 主要试剂 血液基因组DNA提取试剂盒，上海莱枫生物科技有限公司产品；2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)、DNA Marker DL 2 000，北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 Sorvall Legend Micro 17型微量离心机，Thermo Scientific公司产品；MC proS型梯度PCR仪，Eppendorf公司产品；DYY-7C型稳压稳流电泳仪、JY系列电泳槽，北京六一生物科技有限公司产品；Gel Doc XR+型凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 提取血液样本DNA 所有奶牛抗凝血液样本使用移液器吸取200 μL，按试剂盒操作步骤提取100 μL血液DNA，置-20℃冰箱中保存待测。

1.2.2 引物设计和PCR扩增 参照文献[4]设计牛温氏支原体特异性引物，两轮PCR反应程序均为94℃ 5 min，35个循环(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min)，72℃延伸10 min；参照文献[5]设计牛嗜血支原体未定种特异性引物，反应程序为95℃ 5 min，35个循环(94℃ 30 s，58℃ 2 min，72℃ 1 min)，72℃延伸10 min；参照文献[6]设计环形泰勒虫特异性引物，反应程序为94℃ 5 min，35个循环(94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min)，72℃延伸10 min；参照文献[7]设计T.sergenti特异性引物，反应程序为94℃ 5 min，35个循环(94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min)，72℃延伸10 min(表1)。

PCR反应体系均为25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL，ddH2O 10.9 μL，上、下游引物各 0.3 μL，DNA 模板1 μL。每次PCR扩增均设阳性对照和阴性对照，阳性对照样本为M.wenyonii、CandidatusM.haemobos、T.annulata和T.sergenti，由塔里木大学兽医寄生虫学实验室鉴定保存，阴性对照为双蒸水(表1)。

表1 引物序列和目的片段

1.2.3 序列对比和系统发育分析 将PCR扩增阳性产物送至苏州金唯智科技有限公司进行双向测序。在GenBank数据库中进行Blast搜索，下载参考序列，用Clustalx 2.1软件比对和校准序列。用Mega 7.0软件选择邻接算法中Kimura-2-parameter模型，构建种系发育进化树，其可靠性用Bootstrap分析检测，进行1 000个重复。

2 结果

2.1 嗜血支原体和泰勒虫PCR扩增检测结果

基于牛M.wenyonii的SSUrRNA基因位点，对85份血液样本DNA进行PCR扩增，获得目的条带大小为738 bp，13份与阳性样本目的条带相一致(图1)。基于牛CandidatusM.haemobos的SSUrRNA基因位点，对85份血液样本DNA进行PCR扩增，获得目的条带大小为500 bp，11份与阳性样本目的条带相一致(图2)。基于T.annulata的30ku基因位点，对85份血液样本DNA进行PCR扩增，获得目的条带大小为721 bp，7份样本与阳性样本目的条带相一致(图3)。基于瑟氏泰勒虫MPSP基因位点，对85份血液样本DNA进行PCR扩增，未检测到目的条带。

2.2 奶牛嗜血支原体和泰勒虫PCR检测结果

对85份奶牛血液样本DNA进行检测，嗜血支原体和泰勒虫的PCR总阳性率为23.5%(20/85)，M.wenyoniiPCR阳性率为10.6%(9/85)，CandidatusM.haemobosPCR阳性率为3.5%(3/85)，M.wenyonii和CandidatusM.haemobos混合感染PCR阳性率为1.2%(1/85)，牛CandidatusM.haemobos和T.annulata混合感染病原PCR阳性率为4.7%(4/85)，M.wenyonii、CandidatusM.haemobos和T.annulata混合感染PCR阳性率为3.5%(3/85)(表2)。天湖镇和河畔镇奶牛血液病原感染率分别为39.5%(15/38)和26.3%(5/19)，双丰镇奶牛未检测出血液病原阳性。

M.DNA标准DL 2 000；1～16.样品编号；N.阴性对照；P.阳性对照 M.DNA Marker DL 2 000; 1-16.Sample numbers; N.Negative control; P.Positive control

M.DNA标准DL 2 000；1～15.样品编号；N.阴性对照；P.阳性对照 M.DNA Marker DL 2 000; 1-15.Sample numbers; N.Negative control; P.Positive control

M.DNA标准DL 2 000；1～7.样品编号；N.阴性对照；P.阳性对照

2.3 嗜血支原体和泰勒虫基因碱基序列分析

13条M.wenyonii序列经比对分析，鉴定出3种基因型，1种为已知基因型，命名为Mw-1228 (n=11)，与重庆牛源M.wenyonii分离株序列(GenBank登录号：FJ375309)同源性为100%；2种为新基因型，分别命名为Mw-1281 (n=1)和Mw-1270 (n=1)，与重庆牛源M.wenyonii分离株序列(FJ375309)在不同的碱基位点有1个碱基差异，同源性为99.9%。11条CandidatusM.haemobos序列经比对分析，鉴定出3种基因型，1种为已知基因型，命名为CMh-1240(n=6)，与古巴牛源CandidatusM.haemobos分离株序列(MG948630)同源性为100%；2种为新基因型，分别命名为CMh-1274(n=4)和CMh-1242 (n=1)，分别与古巴牛源Can-didatusM.haemobos分离株序列(MG948630)有1个和9个碱基差异，同源性分别为99.8%和98.2%；7条T.annulata序列经比对分析，鉴定出3种新基因型，分别命名为TLA-1278 (n=3)、TLA-1274 (n=2)和TLA-1275 (n=2)，TLA-1278和TLA-1274分别与新疆牛源T.annulata分离株序列(MF116148)和(MF116146)有4个和12碱基差异，同源性分别为99.3%和98.2%，TLA-1275则与荷兰牛源T.annulata分离株序列(AF214896)有11个碱基差异，同源性为98.3%。

2.4 嗜血支原体和泰勒虫的种系发育分析

进化树显示3种M.wenyonii基因型序列与羊嗜血支原体(M.ovis)、羊嗜血支原体未定种(CandidatusM.haemovis)、猪嗜血支原体(M.suis)、羊驼嗜血支原体未定种(CandidatusM.haemolamae)和猫嗜血支原体未定种(CandidatusM.haemominutum)处于一个进化支上；3种牛嗜血支原体未定种基因型序列与人嗜血支原体未定种(CandidatusM.haemohominis)、鼠嗜血支原体(M.haemomuris和M.coccoides)、犬嗜血支原体未定种(CandidatusM.turicensis)和猫嗜血支原体(M.haemofelis)处于另一个进化支上。T.annulata的TLA-1278序列与T.annulata参考序列形成一个亚群支，而T.annulata的TLA-1274和TLA-1275序列与T.annulata参考序列形成一个亚群支。

表2 铁门关市散养奶牛嗜血支原体和泰勒虫感染情况

空心和实心的图标(圆形和三角形)分别表示本研究获得的已知基因型和新基因型序列 Hollow and solid ICON (triangles and circles) represent known genotypes and new genotypes obtained in this study,respectively

黑色菱形表示本研究获得的新基因型序列 The black diamond represents the new genotype sequences obtained in this study

3 讨论

在世界范围内，牛普遍感染嗜血支原体[8-10]。本研究中，嗜血支原体感染率为23.5% (20/85)，M.wenyonii和CandidatusM.haemobos感染率分别为15.3% (13/85)和12.9% (11/85)，不同地区牛感染嗜血支原体有差异性，可能与地理环境、养殖条件、媒介种类分布等因素存在密切关系。新疆南疆奶牛泰勒虫感染率为22.5% (111/493)，T.annulata和T.sergenti感染率分别为22.5% (111/493)和0.6% (3/493)[11]。本次调查检测出的7份泰勒虫样本均为T.annulata，未发现T.sergenti，说明T.annulata因蜱种类的分布而存在区域性遗传进化特征。

新疆南疆地区为典型的荒漠与半荒漠气候，虫媒分布范围广、种类多，如亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)是该地区T.annulata的主要传播媒介之一。牛在散养条件下，更易遭受虫媒的侵袭，应进一步开展铁门关区域内虫媒传播病原的动力学调查，同时应加强对牛源虫媒的防治和灭杀。