冯 颖 赵淑敏 王中英 刘 艳

1.菏泽医学专科学校内科教研室，山东菏泽 274000；2.菏泽医学专科学校附属医院内分泌科，山东菏泽 274000

糖尿病（diabetic mellitus，DM）是最常见的代谢性疾病之一，严重影响人类身心健康，国际糖尿病联盟2019年的资料显示，在世界范围内DM 患病人数已达10 亿人，预计该数字将在2030年增加25%，在2045年增加51%[1]。 糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是DM 患者最常见的慢性并发症之一。一项对400 名2型糖尿病患者的研究发现，将近一半的患者有微量白蛋白尿[2]，是DM 患者死亡的主要原因之一。

近年来有研究显示，氧化应激与DM 及其并发症的发生发展密切相关[3]。 DN 患者应用硫辛酸（lipoic acid，LA） 可以降低血清中炎症细胞因子的水平并改善肾脏功能[4]。 DN 患者应用LA 是否影响NLRP3 炎症小体表达，目前鲜有报道，本研究拟观察高血糖对培养的人肾小球系膜细胞（human glomerular mesangial cells，HMC）中NLRP3 炎症小体表达的影响，并通过观察LA 对高糖诱导的HMC 中NLRP3 炎症小体表达的影响，探讨LA 对肾脏保护作用及可能作用机制，以期探寻DN 发病的新机制和防治新策略。

1 对象与方法

1.1 主要仪器与试剂

人HMC 购自美国ATCC 公司；10%胎牛血清的DMEM 培养液、青霉素-链霉素双抗、胎牛血清及胰酶购自美国HyClone；LA 购自美国Sigma 公司； 细胞计数试剂盒-8 购自同仁化学研究所；Real Time PCR 试剂盒购自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）；分光光度计购自Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA，USA）；NLRP3 抗体购自北京中杉。 蛋白上样缓冲液、PBS 粉剂脱脂奶粉、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天生物试剂公司。

1.2 实验分组及方法

实验分为：NG 组、HG 组、LA 组、HG+不同浓度LA组（分别为50、100、200、300、400 μmol/L）。NG 组：葡萄糖浓度为5.6 mmol/L，HG 组：葡萄糖浓度为20 mmol/L，LA 组： 依据细胞存活率， 选择明显抑制细胞增殖的LA 浓度。

1.2.1 CCK-8 方法检测细胞存活率 HMC 株解冻复苏后， 接种到含10%胎牛血清的DMEM 培养液的培养瓶中，并置于37℃，含5% CO2，饱和湿度的孵箱中培养，定时观察细胞的生长状态。观察细胞生长至75%～85%时， 胰酶消化制成单细胞悬液。 以3.5×104/ml 的细胞密度接种于96 孔板内， 置于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。 LA 预处理12 h 后高糖刺激48 h，48 h 后每孔加入10 μl CCK-8 试剂，轻摇，37℃孵育3 h，酶标仪（λ=450 nm）记录各孔的吸光度（optical delnsity，OD），取4 孔OD 值的平均数，按公式计算细胞存活率，细胞存活率（%）=处理组OD/NG 组OD×100%，重复3 次。

1.2.2 流式细胞术检测细胞内ROS 水平 实验时取对数生长期的细胞，胰酶消化培养液中和后，制成单细胞悬液。 以3.5×105/ml 的细胞密度接种于六孔板的四个孔中， 培养12 h 使之贴壁，LA 组、LA+HG 组加入浓度为200 μmol/l 的LA 处理12 h 后，HG 组、LA+HG 组高糖刺激48 h， 然后弃上清，PBS 漂洗1 次后，加入新鲜配制的DCFH-DA（10 μmol/L），每孔1 ml，37℃避光孵育20 min，PBS 漂洗2 次后， 上机流式检测ROS 的表达水平。

1.2.3 RT-PCR 检测NPR-A mRNA 的表达 按“1.2.2”实验处理细胞，按试剂盒产品说明书进行，采用TRNzol 总RNA 提取试剂进行样本RNA 提取。 纯度和浓度通过使用Nanodrop ND-1000 分光光度计测量A260 nm/A280 nm 来确定。使用2-△△CT方法分析数据。

1.2.4 Western-blot 检测NLRP3 蛋白的表达 按“1.2.2”实验操作分组并处理细胞，蛋白提取后，检测蛋白浓度， 蛋白15 μl 上样并电泳。 电泳后转印到PVDF 膜上，质量分数5%脱脂奶粉封闭并用TBST 清洗后分别加入稀释过的蛋白抗体 （一抗），4℃过夜，BST 清洗3 次，快晃，每次持续10 min；将二抗按一定的比例（1∶2000）稀释于封闭液中，用TBST 清洗3 次，快晃，每次持续10 min。 化学发光，显影，定影，使用UVP 凝胶图像处理系统Labworks4.6 软件。

1.3 统计学方法

应用SPSS 19.0 统计软件进行分析， 实验数据均采用均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析， 组间两两比较采用LSD-t 检验， 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度LA 对人HMC 细胞存活率的影响

NG 组、HG 组、HG+不同浓度LA 组（分别为50、100、200、300、400 μmol/L）。 如图1 所示，与NG 组相比，HG 组细胞活性明显增高，提示高糖环境可促进细胞的增殖。与HG 组相比，HG+不同浓度LA 组可抑制高糖情况下细胞的增殖， 当LA 浓度为200 μmol/L时，明显抑制细胞增殖，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1），200 μmol/L 的LA 浓度为本次实验选择的浓度。

图1 CCK-8 检测不同浓度LA 对HMC 细胞存活率的影响

2.2 流式细胞术检测ROS 的表达水平

图2 结果显示，NG 组ROS 的表达水平（0.15±0.05）和LA 组ROS 的表达水平（0.17±0.04）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），HG 组ROS 表达水平为（1.08±0.11），高于NG 组，差异有统计学意义（t=1.73，P＜0.05），加入LA 后，HG+LA 组ROS 表达水平为（0.22±0.08），低于HG 组，差异有统计学意义（t=1.89，P＜0.05）。

图2 流式细胞术检测ROS 表达水平

2.3 RT-PCR 检测NLRP3 mRNA 的表达水平

图3 结果显示，NG 组（0.79±0.07）和LA 组（0.73±0.08）NLRP3 mRNA 的表达水平没有明显变化，HG 组NLRP3 mRNA 表达水平（1.08±0.11）高于NG 组，差异有统计学意义（t=0.98，P＜0.05）。 加入LA 后，HG+LA组NLRP3 mRNA 表达水平为（0.68±0.02）， 低于HG组，差异有统计学意义（t=1.05，P＜0.05）。

图3 RT-PCR 检测NLRP3 mRNA 的表达

2.4 Western-blot 检测HMC 中蛋白表达

图4 结果显示，HG 组NLRP3 炎症小体高于NG组，HG+LA 组的NLRP3 炎症小体低于HG 组， 差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 Western-blot 检测NLRP3 炎症小体蛋白的表达

3 讨论

炎症小体被认为是DN 的关键病理生理机制，NLRP3 炎症小体是炎症反应的重要组成部分， 参与了DN 的发生发展过程[5]。 NLRP3 炎症小体在先天免疫中起重要作用， 但NLRP3 炎症小体的激活机制尚不清楚。 研究发现，在人或动物模型中，NLRP3 炎症小体的不适当激活与许多疾病有关，例如炎症疾病和自身免疫性疾病[5-6]。 NEK7 是一种多功能激酶，可影响中心体复制、DNA 修复和有丝分裂纺锤体组装[7]。研究发现NEK7 可调控NLRP3 炎症小体信号通路的基因转录或蛋白质表达。 NEK7 的抑制剂可影响NLRP3 炎症小体的表达进而消除炎症反应，NEK7 可能是NLRP3 炎症小体相关疾病的潜在治疗靶点[7]。α-LA 是天然存在的微量营养素， 可充当线粒体酶活性的辅助因子，由于其潜在的抗氧化剂活性，被认为是通用抗氧化剂。 长期应用α-LA 被证明可以改善肾功能，主要机制是其可改善DN 氧化应激状态[8]，DN 是DM 最常见的慢性微血管并发症之一，是导致患者终末期肾脏疾病主要原因之一[9]，实验证据表明，氧化应激和炎症反应是DN 的重要发病机制[10]。

炎症小体是一种多蛋白复合物，可通过促进细胞因子的产生和分泌来增强炎症反应。 NLRP3 炎症小体作为炎症小体家族成员之一，被认为是炎症和自身免疫性疾病的关键介体[11]，已有研究证实，NLRP3 炎症小体高表达可促进氧化应激，加速DM 并发症的发生发展[12]。 近年来，许多的临床和基础实验研究证实，NLRP3 炎症小体可增加肾小球硬化和肾小管纤维化的发生发展[13]。 在高脂饮食/链脲佐菌素诱导的DN 大鼠实验中发现，DN 大鼠的ROS 和NLRP3 炎症小体表达增加，干扰NLRP3 炎症小体表达可延缓DN 的发生发展[14-15]。ROS 的大量生成，诱发肾脏纤维化及炎症反应，并通过促进脂质过氧化、DNA 损伤及线粒体功能紊乱导致肾组织损伤[16]，足细胞是粘附于肾小球毛细血管的上皮细胞，可调节肾小球滤过屏障的完整性，不可逆的足细胞损伤引起肾小球炎症， 并引起慢性肾脏疾病， 裂解补体C5b-9 在足细胞中通过抑制NLRP3 炎症小体表达， 可能有助于肾炎症疾病的靶向治疗[17]。在高脂饮食/链脲佐菌素诱导的DM 小鼠实验中发现， 下调氮氧化物4 的表达和抑制TXNIP/NLRP3途径介导的细胞凋亡有助于糖尿病并发症的治疗[18]。

HMC 是肾脏最为重要的固有细胞之一， 对于肾小球毛细血管簇的形成至关重要[19]。 高糖和高脂多糖可激活HMC 中的ROS/TXNIP/NLRP3/IL-1β 炎症小体信号传导，参与DN 进展[20]。本实验结果显示HG 组较NG 组、LA 组ROS 水平增加， 证实高血糖可增加HMC 氧化应激水平， 本实验也显示HG 组较NG 组、LA 组NLRP3 炎症小体水平表达升高，表明高血糖可能通过氧化应激途径增加NLRP3 炎症小体的表达，从而加重DN 的发生发展。 α-LA 是预防DM 及其并发症的重要抗氧化剂， 它可以再生其他抗氧化剂，例如维生素E，维生素C，辅酶Q10 和谷胱甘肽等，被称为通用抗氧化剂[21]。 然而α-LA 可以改善肾功能损害是否与NLRP3 炎症小体有关鲜有报道， 本研究发现与HG 组比较，HG+LA 组ROS、NLRP3 炎症小体表达水平下降，差异有统计学意义，LA 作为重要的抗氧化剂， 对DN 的保护作用可能与通过降低NLRP3 炎症小体的表达有关，从而为DN 提供新的治疗思路。

综上所述，高血糖使ROS、NLRP3 炎症小体水平升高可能是导致DN 进展的原因之一，LA 保护高糖环境下HMC 的分子学机制可能与抑制ROS、NLRP3炎症小体表达有关，从而抑制DN 的发生发展。