覃新云　刘桂秀　吕其壮　邓家华　覃婷　龙金桃　陈旭健

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒;ORF5基因;遗传进化分析;重组分析

中图分类号： S852.65 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2022）01-0285-04

Key words： porcine reproductive and respiratory syndrome virus;ORF5 gene;genetic evolutionary analysis;recombination analysis

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），俗称“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性、具有高度传染性疾病，其主要临床症状表现为持续高热、母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸困难和高死亡率[1-2]。PRRS最早发现于美国的北卡罗来纳州，随后世界各国陆续报道，中国于1996年首次报道该病。2006年出现了由高致病性PRRSV引起的“猪无名高热症”疫情的大面积暴发和流行，导致猪群高发病率及高死亡率，给养猪业造成了巨大的经济损失[3]。

PRRSV是一种单股正链RNA病毒，其基因组长度约14 500 bp，编码区至少包括10个开放阅读框（ORF）[4]。其中，ORF5基因可以编码病毒的主要结构蛋白GP5，该蛋白质是一种糖基化囊膜蛋白质，也是PRRSV 诱导机体产生中和抗体的主要抗原[5]。研究结果证实，GP5蛋白是PRRSV中最容易发生变异的蛋白质之一，常被用作评价PRRSV病毒是否发生变异的主要依据之一，ORF5基因也因此成为序列分析的典型基因，可作为PRRSV基因分型的重要依据，在PRRSV流行性株遗传变异研究中发挥重要作用[6]。当前在中国境内的PRRSV可分为2个血清型，即PRRSV2 （以VR-2332毒株为代表）和PRRSV1 （以Lelystadvirus毒株为代表），其中PRRSV2又可分为5个基因亚型（lineage 1、lineage 3、lineage 5、lineage 8、lineage 9），lineage 1包含NADC30、JL580等毒株;lineage 3包含QYYZ、GM2等近年来在华南地区流行的低致病毒株;lineage 5包含PRRSV2代表毒株VR-2332;lineage 8包含以TJ、JXA1、TA-12等高致病毒株和以CH-1a等为代表的经典毒株及2011年于新疆地区发现的lineage 9[7-11]。

为研究中国近年来PRRSV流行毒株和变异特征，本研究从GenBank中随机取回分离于中国2010-2019年的877株PRRSV的ORF5基因序列，并对其进行遗传进化和重组分析，以期为监测中国猪群中PRRSV的变异情况和防控PRRS提供参考。

1 材料与方法

1.1 PRRSV ORF5基因序列的收集

从GenBank数据库中随机取回877株2010-2019年分离于中国29个省、市和自治区的PRRSV的ORF5全基因序列作为分析样本，同时，收集24株各PRRSV基因亚型的代表毒株和22株邻国毒株作为参考毒株。为了更好地呈现分析结果，在877株毒株中随机选取98株代表毒株用于后续分析。

1.2 PRRSV ORF5基因的系统发育分析

采用Neighbour-joining （NJ）方法，参照文献[12]进行参数设置，利用软件MEGA v.10.0.5绘制本研究获得的877株PRRSV的ORF5基因序列与参考毒株ORF5基因序列的分子进化树，应用徐铮等[13]提出的基因分型方法对毒株进行类群划分并分析其进化关系及各基因亚型在中国的流行情况。

1.3 PRRSV ORF5基因序列分析

利用DNAstar中的MegAlign程序将收集的ORF5基因序列与参考毒株的ORF5基因序列进行核苷酸同源性分析，并对ORF5基因推导的氨基酸序列进行对比分析，其中以PRRSV2代表毒株VR-2332为氨基酸序列比对时的标准毒株[6，8]。

1.4 PRRSV ORF5基因的重组分析

为研究所收集毒株之间的基因重组情况，利用软件RDP4.0中的7种检测算法[RDP （R）、MaxChi （M）、BootScan （B）、GeneConv （G）、3seq （T）、SiScan （S）和Chimaera （C）]对获得的ORF5基因进行重组分析，并参照文献[14-15]中的判定依据对检测出的重组事件进行界定。

2 结果与分析

2.1 PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性比对及遗传演化分析

分析结果显示，PRRSV ORF5基因序列的长度为600 bp、603 bp和606 bp，核苷酸同源性为59.6%～100.0%，与国内外46株参考毒株的ORF5基因同源性为59.4%～100.0%。ORF5基因进化树分析结果表明，877株PRRSV毒株中有15株为PRRSV1，862株为PRRSV2毒株。PRRSV2又可进一步划分为多个不同基因亚型，其中高致病性毒株（亞型1）有517株、经典毒株（亚型2）有74株、广东新变异毒株（亚型3）有62株、JXA-R疫苗样毒株（亚型4）有29株、NADC30/NADC34样毒株（亚型5）有115株以及分离于新疆地区的毒株（亚型9）有6株。进一步分析发现，除上述6种已发表的基因亚型外，又出现几个与之明显不同的分支，将其分别命名为亚型6（32株）、亚型7（4株）、亚型8（23株）。

2.2 不同基因亚型PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列对比

根据文献报道，当前PRRSV2 GP5蛋白中存在1个信号肽、2个高变区（HVR1和HVR2）、3个跨膜区（TM1、TM2和TM3）以及5个表位结构（DE、NE、T1、T2、TM3），另有位于第13位和151位氨基酸位点的2个毒力相关位点[6，14-15]。本试验从PRRSV1和PRRSV2毒株1～5基因亚型中随机选取代表毒株与本试验获得的98株代表性分析毒株的GP5蛋白氨基酸序列进行对比分析。结果表明，中国PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列中普遍存在变异。相比于PRRSV2的代表毒株VR-2332、PRRSV1毒株和亚型7均在第33～34位氨基酸位点处插入2个氨基酸;相比于PRRSV1的代表毒株，亚型6和亚型7分别在第34位氨基酸位点、58位氨基酸位点处出现1个氨基酸缺失。而Genotype 1和Subgenotype 7毒株均在33～34位氨基酸位点处插入2个氨基酸，其余的突变主要表现为各氨基酸位点的点突变。

2.3 PRRSV ORF5基因的重组分析

重组分析共检测到11个重组事件，其中，2个是明确的重组事件，9个是潜在的重组事件[16-18]。在明确的重组事件中，重组事件2的重组体是毒株MH422060（NCBI登录号：HLJ/HEB/2016/1031b），其主要亲本是毒株KX815428（NCBI登录号：15SC3），次要亲本是毒株MK450614（NCBI登录号：2018113Zhangshu6），重组区域大约发生在ORF5基因序列的270～570 bp。

3 讨论

近年来，中国陆续报道新的突变毒株，使得中国的PRRSV流行毒株更加多样化，变异进程加快，防控更加复杂化[16，19-21]。虽然中国已采取疫苗免疫的方法进行防控，但高致病性毒株減毒活疫苗的无序使用造成减毒活疫苗病毒的大量传播，使得PRRS仍然是严重危害中国养猪业的重要疫病之一[22]。通过对PRRSV基因组特征和遗传进化分析发现，基于选择压力的变化和病毒自身进化的需要，PRRSV不断发生变异和重组，尤其是在NSP2和GP5  2个最易变异的蛋白质上面，这给PRRS的防治带来了更大困难，因此PRRSV NSP2和ORF5基因也常被用作PRRSV各流行毒株间遗传进化分析的靶基因。

通过对新鉴定亚型进行地理区分分析，我们发现以KY373214、MF133296等为代表的新亚型6主要在广西、河南、四川、山东等地被检出;以KC527830、KX815419为代表的新亚型7主要在广东、浙江等地被检出;以MK291407、KP998415为代表的新亚型8主要在中国台湾地区被检出，且新亚型6与PRRSV1，新亚型7与lineage 3，新亚型8与lineage 1亲缘关系较近，表明目前中国的 PRRSV呈现多基因亚型并存的局面，且基因亚型的种类有进一步增多的趋势。

通过对PRRSV ORF5基因编码蛋白质的变异分析发现，其存在多处点突变，个别基因型或基因亚型还存在碱基插入和缺失的情况，该情况可能导致已有的PRRSV疫苗免疫效果不佳或失败，更可能导致新型变异毒株的出现。此外，与毒力有关的第13位和第151位氨基酸位点的比对结果显示，这些毒力位点的突变有可能会导致PRRSV流行毒株毒力的改变，甚至会出现新的高致病性毒株。

对PRRSV ORF5基因的重组分析结果表明，基于中国不同地区的877株PRRSV ORF5基因共检测到11个可能的重组事件，但是根据Tomitaka等[18]和Li等 [16]的结果判断原则，其中只有2个是明确的重组事件，虽然重组事件1中重组体MK689083（新亚型6）的主要亲本尚不明确，但其次要亲本MT036931却是亚型4，即高致病性PRRSV减毒疫苗毒株或演化毒株。重组事件2中的重组毒株MH422060（亚型2，即经典毒株）来源于KX815428（亚型5，即NADC30-like毒株）和MK450614（亚型1，即高致病性毒株）的重组，这与陈盛楠等[14]和Xie等[19]对中国部分地区PRRSV变异分析的结果一致，说明中国PRRSV毒株间的重组频频发生是导致新的突变毒株出现的主要原因之一。特别值得注意的是，虽然利用RDP4软件并未检测到PRRSV1与PRRSV2毒株之间存在基因重组的情况，但通过氨基酸序列比对发现，亚型7的第1～56个氨基酸与PRRSV2代表株高度同源，其第62～201个氨基酸却又与PRRSV1代表株高度同源，提示亚型7可能来源于PRRSV1与PRRSV2毒株间的基因重组。众所周知，基因重组可能会导致病毒的抗原表位发生变化，从而导致病毒发生变异，这既是病毒发生变异产生新的亚群的一种方式，也是疫苗特异性免疫失败的一个重要原因[23]。对重组事件进一步分析发现，所收集877株PRRSV ORF5基因的重组情况主要分布在广东、吉林、河南、浙江、江西、黑龙江、安徽等地，其中在河南检出最多，其次是山东，提示将来这些地方的PRRSV防控应以重组毒株为主。

本研究基于877株中国2010-2019年 PRRSV ORF5基因序列对中国近年来PRRSV流行毒株的变异情况进行了分析，本研究结果为进一步研究中国PRRSV的遗传演化，筛选新的疫苗候选株和开发新型疫苗防控PRRS具有重要意义。

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（責任编辑：陈海霞）

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