龙国斌 甘国兴※ 向燕芬 朱卫星 陈小锐 李润虹 陈海明

（1.清远市中医院广东省鲜药民族医药工程技术研究中心，广东 清远 511500；2.清远市中医院药学部，广东 清远 511500；3.清远市食品药品检验所，广东 清远 511500）

四制益母草是岭南特色炮制中药饮片，清代何克谏撰写的《生草药性备要》中记载四制益母草的炮制方法为“加童便米醋黄酒姜汁同浸也”[1]。《广东省中药炮制规范》记载四制益母草炮制方法为“取净益母草，用盐、醋、姜和酒混合液拌匀吸尽后，蒸2 小时，晒干……”[2]。2 种炮制方法所用辅料和工艺均存在差异，工艺的差异主要是蒸制和浸泡这2 个关键环节。前期研究发现，童便、米醋、黄酒、姜汁混合液炮制的四制益母草中盐酸益母草碱含量明显高于盐、米醋、黄酒、姜汁混合液炮制的四制益母草，而二者盐酸水苏碱含量相当。本文以童便、米醋、黄酒、姜汁为辅料，考察蒸制和浸泡对四制益母草中药效成分盐酸益母草碱和盐酸水苏碱含量的影响，为优化四制益母草炮制方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材与辅料 净制益母草饮片（广州市志宁药业有限公司生产，产地：湖北，批号：190601）经清远市中医院朱卫星主任中药师鉴定为唇形科植物益母草Leonurusja ponicas Houtt.的干燥地上部分，黄酒（绍兴吴越酿酒有限公司酿造，酒精度15%vol），9°米醋（山西老陈醋集团有限公司生产），食用盐（广东省盐业集团有限公司专营），生姜购自清远市先锋市场，童便取自一名5 岁健康男童。

1.1.2 仪器设备 2695-2489 型高效液相色谱仪（Waters公司）、WT3002 型电子天平（杭州万特衡器有限公司监制）、Agilent 1260 InfinityⅡ蒸发光高效液相检测器（安捷伦公司）、XMTD-7000 型电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）、DHG-9023A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、XS205 型十万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）、DFT-100 型100 克手提式高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）等。

1.1.3 试剂 盐酸益母草碱（中国食品药品检定研究院，批号：111823-201704）、盐酸水苏碱（中国食品药品检定研究院，批号：110712-201916）、1-辛烷黄酸钠（河南省万佳首化生物科技有限公司，批号：DE821040）、乙醇（广州化学试剂厂，批号：2019030118，分析纯）、磷酸（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20150804B，分析纯）、乙腈（默克股份两合公司，色谱纯）、超纯水等。

1.2 方法

1.2.1 辅料制备 取童便530 g，米醋530 g，黄酒530 g，生姜汁160 g（530 g 生姜榨汁所得），混匀即得。

1.2.2 炮制方法

1.2.2.1 润1 h 取净制益母草饮片300 g，平均分为6份，每份50 g。取上述益母草饮片1 份，加入混合辅料16.5 g，拌匀闷润1 h，置电热恒温鼓风干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.2 润1 h+蒸2 h 取上述益母草饮片1 份，加入混合辅料16.5 g，拌匀闷润1 h，置蒸锅中蒸2 h，取出放凉，置电热恒温鼓风干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.3 浸泡1 h 取上述益母草饮片1 份，加入混合辅料250 g（预实验提示5 倍量的辅料才能完全浸泡药材）浸泡1 h，取出益母草饮片，收集浸泡液，益母草饮片置电热恒温鼓风干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.4 浸泡1 h+蒸2 h 取上述益母草饮片1 份，加入混合辅料250 g 浸泡1 h，取出益母草饮片，收集浸泡液，益母草饮片置蒸锅中蒸2 h，取出放凉，置电热恒温鼓风干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.5 浸泡3 h 取上述益母草饮片1 份，加入混合辅料250 g 浸泡3 h，取出益母草饮片，收集浸泡液，益母草饮片置电热恒温鼓风干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.6 浸泡3 h+蒸2 h 取上述益母草饮片1 份，加入混合辅料250 g 浸泡3 h，取出益母草饮片，收集浸泡液。益母草饮片置蒸锅中蒸2 h，取出放凉，置电热恒温鼓风干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.3 水分测定 分别取1.2.2 项下益母草炮制品和净制益母草饮片粉碎，按照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）[3]2015 年版四部水分测定法第二法（烘干法）测定其水分。

1.2.4 水溶性浸出物测定 分别取1.2.2 项下益母草炮制品和净制益母草饮片粉碎，按照《中国药典》[3]2015 年版四部浸出物测定法（通则2201）项下热浸法测定不同益母草炮制品水溶性浸出物含量：取药材粉末约2 g，置100 mL 锥形瓶中，精密加水50 mL，密塞，称定重量，静置1 h，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物含量（%）。

1.2.5 盐酸水苏碱测定

1.2.5.1 供试品溶液的制备 按照《中国药典》[4]2015 年版中的方法，分别取1.2.2 项下益母草炮制品20 g，用手提式高速粉碎机粉碎，过3 号筛，取粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %乙醇25 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用70 %乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.5.2 对照品溶液的制备 取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，即得。

1.2.5.3 含量测定 按照《中国药典》[4]2015 年版中高效液相色谱法（通则0512）测定。以丙基酰胺键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.2%冰醋酸溶液（80∶20）为流动相，用蒸发光散射检测器检测，理论塔板数按盐酸水苏碱峰计算应不低于6000。分别取对照品溶液5、10 μL，供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

1.2.6 盐酸益母草碱含量测定

1.2.6.1 对照品溶液的制备 取盐酸益母草碱对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL 含30 μg 的溶液，即得。

1.2.6.2 含量测定 按照《中国药典》[4]2015 年版中高效液相色谱法（通则0512）测定。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.4%辛烷磺酸钠的0.1% 磷酸溶液（24∶76）为流动相，检测波长为277 nm，理论塔板数按盐酸益母草碱峰计算应不低于6000。分别精密吸取盐酸益母草碱对照品溶液和1.2.5.1 项下供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

2 结果

2.1 四制益母草水分及水溶性浸出物含量 益母草水分含量为10.46%，符合2015 年版《中国药典》的要求，不同炮制方法制备的四制益母草水分含量在5.96%～7.63%。益母草的水溶性浸出物含量为24.93%，符合2015 年版《中国药典》的要求，不同炮制方法制备的四制益母草的水溶性浸出物含量在23.50%～26.70%，最高的是浸泡1 h+蒸制2 h 的四制益母草，最低的是浸泡3 h的四制益母草。浸泡后蒸制的四制益母草水溶性浸出物含量增加。结果见表1。

表1 四制益母草水分及水溶性浸出物含量 （n=3）

2.2 不同炮制方法对四制益母草中盐酸水苏碱含量的影响 益母草中盐酸水苏碱含量为0.980%，符合2015 年版《中国药典》的要求。不同炮制方法制备的四制益母草中盐酸水苏碱含量在0.367%～0.933%，最高的是润1 h 的四制益母草，最低的是浸泡3 h+蒸制2 h 的四制益母草。蒸制会导致四制益母草中盐酸水苏碱含量减少，浸泡会导致四制益母草中盐酸水苏碱含量明显减少。结果见表2，图1。

图1 盐酸水苏碱高效液相色谱图

表2 不同炮制方法对四制益母草中盐酸水苏碱含量的影响（n=3）

2.3 不同炮制方法对四制益母草中盐酸益母草碱含量的影响 益母草中盐酸益母草碱含量为0.139%，符合2015年版《中国药典》的要求。不同炮制方法制备的四制益母草中盐酸益母草碱含量在0.070%～0.120%，最高的是润1 h 的四制益母草，最低的是浸泡3 h+蒸制2 h 的四制益母草。蒸制会导致四制益母草中盐酸益母草碱含量减少，浸泡会导致四制益母草中盐酸益母草碱含量明显减少。结果见表3，图2。

图2 盐酸益母草碱高效液相色谱图

表3 不同炮制方法对四制益母草中盐酸益母草碱含量的影响（n=3）

3 讨论

中药炮制与其临床疗效密切相关。宋代《太平圣惠方》就提出：“炮制失其体性，筛罗粗恶，分剂差殊，虽有疗疾之名，永无必愈之效，是以医者必须殷勤注意”。明代《本草蒙筌》又载：“凡药制造，贵在适中，不及则功效难求，太过则气味反失……”。清代《修事指南》又载：“炮制不明，药性不确，则汤方无准，而病症不验也”。益母草始载于《神农本草经》，具有活血调经，利尿消肿，清热解毒等作用，用于月经不调，痛经经闭，恶露不尽，水肿尿少，疮疡肿毒。历代医方本草对益母草炮制方法记载颇多，包括炒制、制炭、酒制、醋制、蜜制和四制等。

四制益母草是岭南特色炮制中药饮片，四制能够增强祛瘀生新作用。药理研究表明，益母草活血化瘀的主要成分是盐酸益母草碱和盐酸水苏碱。本研究中，润法炮制的四制益母草，蒸制与未蒸制对水溶性浸出物基本无影响，蒸制后盐酸水苏碱含量略微减少，盐酸益母草碱含量明显减少。浸泡炮制的四制益母草，蒸制后水溶性浸出物增加，盐酸水苏碱含量和盐酸益母草碱含量均减少。与润法相比，浸泡炮制的四制益母草盐酸水苏碱和盐酸益母草碱含量均明显减少。研究结果表明，蒸制对盐酸益母草碱影响较大，浸泡会造成盐酸水苏碱和盐酸益母草碱明显减少。

《生草药性备要》中记载四制益母草的炮制方法为“加童便米醋黄酒姜汁同浸也”。本研究结果表明，浸泡会造成益母草主要药效成分盐酸水苏碱和盐酸益母草碱明显减少，因此认为浸泡法炮制四制益母草是不合理的。《广东中药炮制规范》记载四制益母草炮制方法为“取净益母草，用盐、醋、姜和酒混合液拌匀吸尽后，蒸2 小时，晒干……”。本研究结果提示，蒸制对盐酸益母草碱影响较大，蒸制后盐酸益母草碱含量明显减少，马恩耀[5]研究发现蒸制超过1 h 的四制益母草中盐酸水苏碱和盐酸益母草碱均减少，因此认为蒸制2 h 是不合理的。本研究只是初步探讨蒸制和浸泡对四制益母草盐酸水苏碱、盐酸益母草碱和水溶性浸出物的影响，研究结果可能没有全面系统地反映蒸制和浸泡对四制益母草质量的影响，今后将进一步深入研究阐明蒸制和浸泡对四制益母草质量的影响，为优化四制益母草炮制方法提供参考。