刘新兵，张美红

(枣庄市中医医院 1.风湿病科；2.急诊科，山东 枣庄 277000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以炎性滑膜炎为主的慢性自身免疫性疾病，严重影响患者生存质量。近年来研究显示，类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid orthritis synovial fibroblasts，RASFs)的异常增殖和侵袭促进RA的发生发展[1]，抑制其增殖和侵袭对RA的治疗尤为重要。钩吻碱(gelsemium)是马钱科胡蔓藤属植物钩吻的主要成分之一，具有多种药理活性。研究显示，钩吻碱可能通过抑制JAK2/STAT3/survivin通路的降低人舌癌细胞株Tca8113的增殖能力，并促进细胞凋亡，发挥抗舌癌作用[2]；钩吻碱可抑制人结肠癌细胞和人脐静脉内皮细胞增殖，并降低人脐静脉内皮细胞的迁移、侵袭及血管生成能力[3]。但目前，钩吻碱能否影响RASFs增殖、迁移和侵袭还未见报道。

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类呈闭合环状结构的非编码RNA，参与调控细胞增殖、分化和凋亡等生命活动，在RA的发生发展中起重要作用[4]。Circ_001680属于circRNA家族成员，其在胃癌[5]和结直肠癌[6]中表达升高，促进肿瘤细胞增殖和转移。但目前，circ_001680对RASFs增殖、迁移和侵袭的影响还未知。本研究通过体外分离培养RASFs，主要观察了钩吻碱和干扰circ_001680对RASFs增殖、迁移和侵袭的影响及钩吻碱能否靶向调控circ_001680发挥作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

钩吻碱(gelsemine)，纯度>98 %(成都瑞芬思德丹生物科技有限公司)；DMEM培养基、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)；LipofectamineTM2000试剂盒(Invitrogen公司)；Circ_001680小干扰RNA(si-circ_001680)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、circ_001680过表达载体(si-circ_001680)、空载体(si-NC)和PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗人上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏附素(N-cadherin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(Santa Cruz公司)；RNA抽屉试剂盒、反转录试剂盒和PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RASFs的体外分离培养和转染：滑膜组织取自2018年10月至2019年5月于枣庄市中医医院确诊的RA患者，组织取材经本院医学伦理委员会批准(批准号：20180815)，患者知情同意。将手术过程中去除的病变滑膜组织迅速置于预冷的Hank’s平衡盐溶液中，参照文献[7]方法分离培养RASFs：清洗滑膜组织，除去肪组织和骨组织。加5 mL高糖DMEM培养基，手术剪剪碎，用II型胶原酶37 ℃消化6 h，再用50.25 %胰蛋白酶消化细胞1 h。经细胞筛网(70 μm孔径)过滤后，将滤液离心(1 500 r/min、5 min)，弃上清。加含10 % FBS的DMEM培养基，于培养箱中分瓶培养。当细胞汇合度至80 %时，换液传代，用第3～6代细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞转染和分组处理：将对数期RASFs以1.0×105个/孔接种于6孔板中，用LipofectamineTM2000脂质体法，分别转染si-NC、si-circ_001680、pcDNA、pcDNA-circ_001680，转染12 h后，更换培养基。再培养24 h，RT-qPCR检测细胞中circ_001680表达验证转染效果。未转染的RASFs分为对照组(用常规培养基培养)和低、中、高浓度gelsemine组(gelsemine-L组、gelsemine-M组和gelsemine-H组，分别用含50、100、200 μg/mL[8]gelsemine的培养基培养)。转染si-NC、si-circ_001680的RASFs用常规培养基培养，记为si-NC组、si-circ_001680组。转染pcDNA、pcDNA-circ_00168的RASFs均用含200 μg/mL gelsemine的培养基培养，记为gelsemine+pcDNA组、gelsemine+pcDNA-circ_001680组。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖：将RASFs均以2.5×104个/孔接种于96孔板中，培养4 h后，弃培养基。分组培养24 h后，加10 μL CCK-8。于培养箱中孵育2 h后，使用酶标仪检测吸光度(A)值，检测波长为450 nm。

1.2.4 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力：将RASFs均以5.0×104个/孔接种于6孔板中，培养 4 h后，弃培养基。分组培养，每2 d换液1次，培养14 d后，弃培养基。经多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜观察，对超过50个细胞的克隆进行计数。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力：将未转染、转染后的RASFs均以1.0×105个/孔接种于6孔板中，培养4 h后，弃培养基。用200 μL移液器枪头沿中轴线划两条平行线，磷酸盐缓冲液清洗除去划痕间细胞，并测量划痕间宽度，记为(d)0 h。分组培养24 h后，再次测量划痕间宽度，记为(d)24 h。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞侵袭：将Transwell小室置于24孔板中，在上室中铺Matrigel基质胶，自然晾干后，加含1.0×104个细胞的细胞悬液，下室加500 μL培养基。培养4 h后，弃培养基。分组培养24 h后，弃培养基。经多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜观察。随机取5个视野，统计侵袭细胞数。

1.2.7 蛋白印迹法检测E-cadherin和N-cadherin蛋白表达：将RASFs均以1.0×105个/孔接种于6孔板中，培养4 h后，弃培养基。分组培养24 h后，RIPA试剂提取细胞中总蛋白。经BCA法定量、12% SDS-PAGE、转膜及5 %脱脂奶粉中封闭2 h后，分别于E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液中进行孵育，4 ℃孵育过夜。再于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中，37 ℃孵育1 h。加显影液避光显影，凝胶系统曝光拍照，Image J软件分析E-cadherin、N-cadherin相对于GAPDH的表达水平。

1.2.8 RT-qPCR检测circ_001680表达：将RASFs均以1.0×105个/孔接种于6孔板中，培养4 h后，弃培养基。分组培养24 h后，用RNA抽屉试剂提取总RNA。经反转录后，行PCR扩增。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。引物序列：circ_001680上游5′-GCTCA CACCAATCCCCTG-3′，下游5′-GCCTGGCACACAG TAGACAC-3′；GAPDH上游5′-GATATTGTTGCCAT CAATGAC-3′，下游5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。2-△△Ct法计算circ_001680相对于内参GAPDH的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 钩吻碱对RASFs增殖的影响

与对照组比较，钩吻碱呈浓度依赖性降低RASFs的A值和克隆形成数(P<0.05)(表1)。

表1 钩吻碱对RASFs增殖的影响

2.2 钩吻碱对RASFs迁移和侵袭的影响

与对照组比较，钩吻碱呈浓度依赖性降低RASFs划痕愈合率和侵袭细胞数及细胞中N-cadherin蛋白表达(P<0.05)，而促进E-cadherin蛋白表达(P<0.05)(图1，表2)。

表2 钩吻碱对RASFs迁移和侵袭及蛋白表达的影响

A.effect of gelsemine on the protein expression of E-cadherin and N-cadherin in RASFs; B.effect of gelsemine on the migration of RASFs; C.effect of gelsemine on the invasion of RASFs

2.3 钩吻碱对RASFs中circ_001680表达的影响

与对照组比较，钩吻碱呈浓度依赖性降低RASFs中circ_001680表达(P<0.05)(表3)。

表3 钩吻碱对RASFs中circ_001680表达的影响

2.4 干扰circ_001680表达对RASFs增殖的影响

与si-NC组比较，si-circ_001680组RASFs中circ_001680表达降低(P<0.05)，RASFs的A值和克隆形成数降低(P<0.05)(表4)。

表4 干扰circ_001680表达对RASFs增殖的影响

2.5 干扰circ_001680表达对RASFs迁移和侵袭的影响

与si-NC组比较，circ_001680组RASFs划痕愈合率和侵袭数及细胞中N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)，而E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)(图2，表5)。

表5 干扰circ_001680对RASFs迁移、侵袭及蛋白表达的影响

A.protein expression of E-cadherin and N-cadherin in RASFs after interference with circ_001680; B.migration of RASFs after interference with circ_001680; C.invasion of RASFs after interference with circ_001680

2.6 过表达circ_001680减轻钩吻碱对RASFs增殖、迁移和侵袭及蛋白表达的作用

转染pcDNA-circ_001680的RASFs中circ_001680表达明显高于转染pcDNA的细胞(3.27±0.28比1.00±0.00，P<0.05)；与gelsemine+pcDNA组比较，gelsemine+pcDNA-circ_001680组RASFs的A值、克隆形成数、划痕愈合率和侵袭数及细胞中N-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，而E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)(图3，表6)。

A.protein expression of E-cadherin and N-cadherin in RASFs over-expressing circ_001680 treated with gelsemine; B.migration of RASFs over-expressing circ_001680 treated with gelsemine; C.invasive over-expressing circ_001680 treated with gelsemine

表6 过表达circ_001680减轻钩吻碱对RASFs增殖、侵袭及蛋白表达的作用

3 讨论

目前，RA缺乏有效的治疗药物。近年来，从天然植物中提取的活性成分生物碱因作用靶点多、效果明显和副作用小等优点，在疾病的治疗中发挥重要作用。研究显示，乌头碱可呈剂量依赖性抑制RASFs增殖，并诱导RASFs凋亡[9]；青藤碱可通过抑制RANK和NF-κB的活化减轻脂多糖诱导的人成纤维样滑膜细胞炎性反应，并阻碍细胞增殖，促进细胞凋亡[10]。有报道称，钩吻碱可显著抑制人脐静脉内皮细胞增殖和迁移，并促进细胞凋亡[8]，但其对RASFs恶性生物学行为的影响还未见相关报道。

本研究主要探讨了钩吻碱对RASFs增殖、迁移和侵袭的影响，结果显示，钩吻碱可呈剂量依赖性降低RASFs的A值和克隆形成数，提示其可抑制RASFs增殖。与肿瘤细胞相似，RASFs具有侵袭性，抑制其对关节软骨的侵袭，可减轻骨关节破坏[11]。本研究显示，钩吻碱降低RASFs划痕愈合率和侵袭数，说明其可阻碍RASFs迁移和侵袭。上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchimal transition, EMT)是细胞失去上皮极性而获得间质细胞特性的过程，主要表现为上皮标志物如E-cadherin表达降低，而间质标志物如N-cadherin表达升高[12]。细胞在经过EMT过程后，细胞间黏附作用降低，细胞骨架发生重组，最终导致其更易向周围组织迁移和侵袭[13]。本研究显示，钩吻碱抑制RASFs中N-cadherin蛋白表达，而提高了E-cadherin蛋白表达，且呈浓度依赖性，提示其可能通过抑制EMT过程来阻碍RASFs迁移和侵袭。

CircRNA在真核生物中广泛存在，参与心血管疾病在内的多种疾病的发展进程[14]。研究已表明，多种circRNA参与RA的发生发展。例如，RASFs中circ_0088036表达升高，其可靶向miR-140-3p/SIRT 1轴促进RASFs增殖和迁移，进而促进RA的发展进程[15]。本研究显示，干扰circ_001680表达对RASFs的增殖、迁移和侵袭起抑制作用，提示其有可能作为RA治疗的分子靶点。本研究还显示，钩吻碱可呈浓度依赖性抑制RASFs中circ_001680的表达，而过表达circ_001680减轻其对RASFs增殖、迁移和侵袭的抑制作用，提示其可能通过下调circ_001680来抑制RASFs增殖、迁移和侵袭。

综上，钩吻碱可抑制RASFs增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能与下调circ_001680表达有关，有可能成为治疗RA的药物。