肖维 李侠

子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)主要指发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤病变，高发于女性围绝经期，作为妇科常见的肿瘤类型，EC的发生被认为与雌激素水平变化、内分泌及代谢紊乱、体型肥胖、基因遗传等因素相关[1-2]。早期EC大多局限于子宫内部，尚未形成大面积远端扩散，尽早接受手术治疗有助于改善患者预后，中晚期EC则需根据肿瘤浸润及转移特性制定相应治疗方案，否则难以控制疾病复发[3]。既往研究结果表明EC肿瘤异质性显著[4]，从分子生物学角度分析，microRNA在肿瘤的发生、细胞增殖及凋亡等进程中发挥重要调控作用，血清microRNA已成为新一代最有潜力的诊断和预后生物标志物之一。其中miR-195被认为经多靶点、多途径共同参与肿瘤疾病进展，其主要发挥抑制肿瘤细胞周期转换、促进细胞凋亡的作用，miR-195的过表达能够限制肿瘤细胞的迁移、侵袭行为，可作为诊断食管癌、结肠癌等恶性肿瘤疾病的生物学参考指标[5]。近期研究显示，miR-195在EC中呈低表达，关于其在EC中的作用机制目前尚不清楚，因此需要深入的研究来阐明miR-195 在EC发生中的功能[6]。为进一步明确人EC组织中miR-195表达水平对疾病进展和患者预后产生的具体影响，本研究将收集本院收治的EC患者临床资料进行分析，现将结果报道如下。

材料与方法

一、一般资料

回顾性分析2014年2月至2015年5月于本院就诊的126例EC病例资料，患者年龄40～69岁，平均年龄(55.74±6.31)岁；病程5个月～6年，平均病程(2.93±1.22)年； BMI平均(24.18±4.67)kg/m2；病理类型：子宫内膜样腺癌97例，腺鳞癌21例，黏液性腺癌5例，透明细胞癌3例；肌层浸润深度：<1/2肌层89例，≥1/2肌层37例；存在淋巴结转移35例，无淋巴结转移91例；分化程度：低分化13例，中分化74例，高分化39例。纳入标准：①符合宫颈癌国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics， FIGO)于2018年发布的《子宫内膜癌诊治指南》[7]相关诊疗标准，结合宫腔镜检查、阴道或经腹超声、分段诊刮、磁共振成像等项目联合确诊为EC；②术前未接受化疗、放疗及其它抗肿瘤治疗；③均于本院接受手术治疗，术中取病理组织样本送检，术后继续给予针对性辅助化疗治疗；④精神及认知正常，配合随访复诊；⑤患者临床资料完整。排除标准：①合并其它类型生殖系统疾病；②心、肺、肾、肝严重损伤；③非EC疾病原因导致死亡者；④既往行子宫及腹腔手术治疗史；⑤合并感染性疾病；⑥凝血功能障碍或先天功能不足者；⑦合并其它类型恶性肿瘤；⑧长期服用免疫抑制剂、糖皮质激素类药物；⑨合并免疫系统及内分泌疾病。

二、检测方法

本研究所使用的仪器及药品包括实时荧光定量RT-PCR仪和Gel DocXR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、UV-3000紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)、Cycleave®PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)、cDNA逆转录试剂盒(美国Femantes公司)、SYBR Green定量PCR反应混合液(美国罗氏公司)，引物来自于上海生物工程公司，上游引物序列为5′-CGTAGCAGCACAGAAAT-3′，下游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGGGT-3′，以U6作为内参对照，其上游引物序列为5′-GTGCTCCCTGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物序列为5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′。取EC患者癌组织以及癌旁距离病灶>5 cm的子宫内膜组织制作病理标本，切取约50 mg组织加入裂解液，经离心匀浆处理后按照试剂盒说明书指示提取RNA，应用分光光度计进行定量；应用cDNA逆转录试剂盒对RNA进行逆转录，RNA逆转录体系20 μl，其中混合液10 μl，上游、下游引物各1 μl，DNA模板2 μl，蒸馏水6 μl，PCR逆转录合成反应条件为预变性95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，共50个循环；PCR扩增结果按照2-ΔΔCt法计算miR-195在组织中的相对表达量，ΔΔCt=肿瘤组织ΔCt-癌旁正常内膜组织ΔCt，ΔCt=Ct(miR-195)-Ct(U6)，每组样本均进行3次重复实验，最终结果取其平均值。

三、观察指标

比较EC癌组织及正常组织中miR-195的表达水平；分析miR-195表达与EC患者年龄、病理类型、肌层浸润深度、淋巴结转移、分化程度等临床资料信息的关系；以术后次日开始作为随访起点，随访方式为电话和门诊复查，随访时间为5年，前3年以内为每3个月随访1次，3年以后为每半年随访1次，记录全部EC相关事件，包括局部复发、远处转移等，将原病变部位和其他部位出现新病灶或残留肿瘤增大定义为病灶复发进展。比较患者5年无进展生存率和总生存率情况。

四、统计学方法

结 果

一、癌组织miR-195表达及与临床病理特征的关系分析

相对于癌旁正常内膜组织，miR-195在癌组织中的相对表达量为(0.38±0.11)， miR-195在不同肌层浸润深度、不同淋巴结转移、不同分化程度癌组织中的表达量均存在显著差异(P<0.05)，见表1。

二、生存结局

随访至术后5年，126例EC患者中共有79例患者存活(62.70%)、47例患者死亡(37.30%)。选择中位数0.30作为miR-195在癌组织中相对表达量的临界值，miR-195表达>0.30为高表达，<0.30为低表达，miR-195高表达组5年生存率为73.02%(46/63)，高于低表达组生存率52.38%(33/63)(log-Rankχ2=5.735，P<0.05)，见图1。

图1 miR-195高表达组与低表达组5年生存情况分析

三、不同临床病理特征患者5年生存情况比较

不同年龄、BMI指数、病理类型患者的5年生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)；肌层浸润深度≥1/2、发生淋巴结转移、低分化、miR-195低表达患者的5年生存率低于肌层浸润深度<1/2、未发生淋巴结转移、中高分化、miR-195高表达患者(P<0.05)，见表2。

表2 不同临床病理特征患者5年生存情况比较(例)

四、影响EC患者预后生存的Logistic回归分析

将上述差异有统计学意义的因素纳入多因素Logistic回归模型，以预后生存结果作为因变量(生存=0，死亡=1)，以上述差异有统计学意义的因素作为自变量，并进行赋值：肌层浸润深度(<1/2=0，≥1/2=1)、淋巴结转移(无=0，有=1)、肿瘤分化程度(低分化=0，中分化=1，高分化=1)、miR-195表达水平(低表达=0，高表达=1)，Logistic回归分析结果显示，肌层浸润深度[OR=3.428(95%CI：1.023～11.488)]、淋巴结转移[OR=2.214(95%CI：1.039～4.719)]均为影响患者预后生存的独立危险因素，高分化[OR=0.601(95%CI：0.374～0.966)]、miR-195高表达[OR=0.713(95%CI：0.535～0.951)]为影响患者预后生存的保护因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响EC患者预后生存的Logistic回归分析

讨 论

有研究显示，早期EC在接受有效治疗后5年生存率可达80%以上[8]，而中晚期EC由于病灶多已向盆腔淋巴结等部位发生转移，术后残余肿瘤细胞仍存在进展风险，因此多数患者预后较差。为进一步探究肿瘤细胞的生物学特性，近年来有关microRNA及其作用靶点的相关研究备受临床关注。microRNA是一种仅有19～22个核苷酸的单链非编码小分子RNA，单一microRNA可同时具有多个靶基因，通过调控下游基因表达，microRNA能够对细胞活动产生直接影响[9-10]。EC等恶性病变的发生往往与促癌、抑癌基因的异常表达相关，了解microRNA在人体内的表达水平将有助于临床全面认识肿瘤的发生机制，从而为临床预测疾病复发转移风险、制定相应治疗干预措施提供有效参考。

本研究结果显示，EC患者术后5年总体生存率为62.70%，与殷勇等[11]的研究结果相近。PCR定量分析结果显示，EC患者癌组织中miR-195表达量低于癌旁内膜组织，与Zhao等[12]的研究结果一致。miR-195主要调控细胞周期相关蛋白，其可能作用于人EC细胞系Ishikawa的p-Akt蛋白，通过激活PI3K/Akt通路调控细胞增殖、侵袭能力[13]；除此之外，miR-195能够引起细胞周期G1/S期阻滞[14]，从而降低肿瘤细胞分裂增殖效率。既往研究指出小分子干扰RNA可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路限制肿瘤细胞的生长发育，在EC的发病过程中发挥潜在影响[15-16]。miR-195对EC癌组织细胞的作用机制可能与此相关。赵小萌等[17]研究显示，上调miR-195能够抑制EC患者EC细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。李万斌等[18]研究也证实miR-195可抑制EC细胞的增殖和转移，与EC患者FIGO 分期、发病类型、浸润深度和术后生存期均密切相关。本研究结果也显示，不同肌层浸润深度、不同淋巴结转移和不同分化程度的EC患者癌组织中miR-195表达均存在显著差异，肿瘤恶性程度越高，预后越差，miR-195表达水平越低。提示临床可结合miR-195检测结果综合评估肿瘤病灶的生物学特性。miR-195的早期检测结果不仅能够体现肿瘤细胞的分裂活跃度，也能够体现抑癌基因在癌组织中的作用强度，便于临床区分不同患者体内癌旁组织的恶变倾向以及分化特点，但本研究未对miR-195在EC中的作用通路进行深入分析，之后将以此作为研究方向，继续收集相关蛋白在EC患者体内的表达水平等相关资料进一步探究。

本研究通过绘制生存曲线发现，miR-195高表达患者生存率高于低表达患者，miR-195表达量偏低表明该项基因对肿瘤细胞增殖抑制作用效果有限，肿瘤细胞更易向肌层浸润，进而发生淋巴结及宫外转移，结果导致患者死亡风险增大。Logistic回归分析结果显示，肌层浸润深度、淋巴结转移均为影响患者预后生存的独立危险因素，肿瘤高分化和miR-195高表达为影响患者预后生存的保护因素。沈家欢等[19]研究表明，淋巴结转移和肌层浸润≥1/2是影响患者2年生存结局的危险因素，与本研究结果一致。miR-195在EC患者预后生存评估中具有重要意义，对于miR-195低表达患者，应尽可能选择根治性手术切除方案，同时应对淋巴结等部位进行全面清扫，以减少肿瘤组织残留，术后应重点关注病灶范围变化，合理规划化疗药物的使用，可结合应用PI3K/Akt/mTOR通路靶向药物辅助强化miR-195对肿瘤细胞的调控功能，从而达到预防疾病复发、改善患者预后的治疗目的[20]。本研究对EC患者癌组织miR-195表达及其与预后的关系进行探讨，但不足之处在于未对miR-195低表达对EC细胞恶性生物学影响机制进行探讨，后续将进一步做深入探究。

综上所述，EC患者癌组织中miR-195表达量显著低于癌旁内膜组织，且与患者的临床病理特征表现密切相关，BMI、肌层浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分化程度及miR-195表达均与患者预后生存结局相关，其中miR-195对于EC患者术后生存预后具有一定预测价值，是影响患者预后生存的保护因素。