张瑾涵， 吴银礴， 田万年， 吕树臣

(吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101)

卵形巴贝斯虫病是经蜱传播，由卵形巴贝斯虫(Babesiaovata)寄生于牛红细胞内引起的血液原虫病[1]。本病具有明显的季节性，一般外地引进牛感染发病较为严重，主要临床症状为高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿[2，3]。1980年，Minami等首次从日本牛的血液中分离到卵形巴贝斯虫[1]。1986、1994年，我国相继在河南省卢氏县、甘肃省张家川回族自治县饲养牛群中发现该病并分离到卵形巴贝斯虫[1]。目前对卵形巴贝斯虫病的诊断主要通过临床症状和血液涂片镜检方法，由于染色剂及相似病原体等因素，易出现误诊。随着现代分子生物学的迅速发展，出现了卵形巴贝斯虫PCR诊断方法[4]。正常生理条件下，热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)在生物体内的表达量较低，当机体处于病原感染或应激状态时其表达量显著升高[5]。相关研究发现，HSP70基因在生物体进化过程中具有高度保守性，目前已应用于梨形虫基因序列系统进化分析[6]。本试验通过对卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因进行PCR扩增测序和系统进化分析，为卵形巴贝斯虫的分类鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料样品来自吉林省珲春地区放牧的8头发病黄牛(主要表现为贫血)，分别采集每头牛的颈静脉血10 mL，置于无菌肝素管中，-20 ℃保存。

1.2 主要试剂、仪器血液DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DL 2 000 DNA Marker[均购自天根生化科技(北京)有限公司]、TaqPreMix(购自华美生物工程有限公司)、PCR仪(型号：大龙TC1000-G)、电泳槽(型号：DYCP-31BN)、低温离心机(型号：Sigma 3K30)。

1.3 血液DNA的提取(1)取抗凝血150 μL加入含有细胞裂解液300 μL的离心管(容积1.5 mL)中，静置5 min，13 000 r/min离心7 min，弃去上清液。(2)在离心管中加入细胞裂解液300 μL，再加入蛋白沉淀液100 μL，充分颠倒混匀，13 000 r/min 离心5 min。(3)将上清液倒入含有异丙醇300 μL的新离心管中，13 000 r/min 离心1 min。(4)弃去上清液，加入70%乙醇300 μL，13 000 r/min 离心 1 min，弃去上清液，自然晾干，最后加入双蒸水(ddH2O) 50 μL，-20 ℃保存备用。上述均为4 ℃低温离心。

1.4 引物设计与合成以卵形巴贝斯虫HSP70DNA序列(GenBank登录号：XM_029011319)为参考序列，应用软件Oligo 6.0设计特异引物。上游引物：5’-ATGTCTGCTCCGGCTATTGGTA-3’；下游引物：5’-TTAGTCCACCTCCTCGACAGTG-3’。预扩增片段大小1 947 bp，引物退火温度55 ℃。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.5 PCR扩增及测序对卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因进行扩增，PCR反应体系25 μL：ddH2O 9.5 μL，TaqPreMix 12.5 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物(浓度10 μmol/L)各0.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性35 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸4 min。PCR扩增产物按DNA回收试剂盒说明书方法进行回收，送吉林省库美生物科技有限公司测序。

1.6 系统进化分析运用MEGA 7.0软件对所测序列与GenBank中的双芽巴贝斯虫(BabesiabigeminaAB482178)、牛巴贝斯虫(BabesiabovisAF107118)、东方巴贝斯虫(BabesiaorientalisEF512547)、驽巴贝斯虫(BabesiacaballiAB248742)、犬吉氏巴贝斯虫(BabesiagibsoniAB440627)、羊巴贝斯虫(BabesiaovisAB248741)、马巴贝斯虫(BabesiaequiAB248743)、分岐巴贝斯虫(BabesiadivergensAB248739)、东方泰勒虫(TheileriaorientalisXM_009693862)、环形泰勒虫(TheileriaannulataXM_948234)、绵羊泰勒虫(TheileriaovisAB248747)、瑟氏泰勒虫(TheileriasergentiD12692)12个参照序列进行比较，构建系统进化树，进行同源性及系统进化分析。

2 结果

2.1 PCR扩增及测序由图1可见：从病料中分离扩增的DNA片段大小为1 947 bp。测序结果显示，卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因与卵形巴贝斯虫日本株(XM_029011319)同源性为99.8%，与双芽巴贝斯虫同源性为95.12%，与牛巴贝斯虫同源性为 86.72%(见图2)。

M：DL 2 000 Marker；1：PCR扩增产物；2：阴性对照图1 HSP70基因PCR扩增结果

图2 基于HSP70基因序列的巴贝斯虫同源性分析

2.2 遗传进化分析由图3可见：卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因与双芽巴贝斯虫(AB482178)亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫(AF107118)及其他虫种亲缘关系较远。

图3 基于HSP70基因序列的巴贝斯虫系统进化树

3 结论

通过对卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因进行PCR扩增，其基因片段大小为1 947 bp；同源性分析表明，与卵形巴贝斯虫日本株(XM_029011319)同源性为99.8%；系统进化分析表明，与双芽巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫及其他虫种亲缘关系较远。

4 讨论

4.1卵形巴贝斯虫病呈世界性分布，我国河南、甘肃、四川、吉林等地也有该病的报道，对牛的危害尤为严重，感染率达30.52%[7]。随着我国养牛业的发展和牛的频繁交易，该病在我国流行区域逐渐扩大，已成为严重威胁养牛业发展的重要疾病之一。白启等[8]通过传播媒介蜱进行人工感染试验表明，卵形巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫各为单独的虫种。

4.2目前国内有关卵形巴贝斯虫的研究较少，据田万年等[9]对卵形巴贝斯虫18S rRNA序列分析结果显示，其与双芽巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫亲缘关系较远。本试验通过对卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因扩增，大小为1 947 bp；测序结果显示其与双芽巴贝斯虫同源性为95.12%，与牛巴贝斯虫同源性较低(86.72%)；系统进化分析表明，卵形巴贝斯虫吉林株HSP70基因与双芽巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫及其他虫种亲缘关系较远。这与田万年等[9]对卵形巴贝斯虫18S rRNA序列分析结果相一致，与曲志强等[10]基于HSP70基因系统进化分析结果(双芽巴贝斯虫与卵形巴贝斯虫亲缘关系较近)相一致。本研究进一步证明了卵形巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫之间的系统发育关系，丰富了卵形巴贝斯虫的遗传进化资料。