不同农业剩余物对秀珍菇菌丝生长的影响

2022-03-04吴楠荆瑞勇秦智田风华王丽艳姚钦李长田

黑龙江八一农垦大学学报 2022年1期

吴楠，荆瑞勇，秦智，田风华，王丽艳，姚钦，李长田

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163316；2.吉林农业大学；3.贵州大学）

秀珍菇Pleurotus pulmonarius（Fr.）Quél.，学名肺形侧耳，又名凤尾菇、凤尾侧耳、肺形平菇、印度鲍鱼菇[1]，隶属真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomvcota），蘑菇纲（Agaricomycetes），蘑菇亚纲（Agaricomycetidae），蘑菇目（Agaricales），侧耳科（Pleurotaceae），侧耳属（Pleurotus）（http：//www.indexfungorum.org/Names/Names.asp）。秀珍菇肉质灰白，口感脆嫩，并产生芳香气味，是平菇家族的佼佼者，在我国栽培广泛。一直以来，被人们制作成各种食品和调味品，广受欢迎[2-3]。不仅如此，秀珍菇还具有丰富的营养价值，其自身含有大量人体所需必需氨基酸、蛋白质、多糖和维生素，已逐渐成为人们餐桌上的常见菜肴[4-5]。秀珍菇具有多种药用功能，在医学各个领域发挥至关重要的作用。秀珍菇子实体具有抗氧化和抗胆碱酯酶等活性，而且可以降低血糖水平，抵抗血管并发症。秀珍菇的多糖-蛋白复合物可以抑制肝癌细胞的增值，对人类肝癌治疗具有十分重要的意义。它还可以激发动物的免疫系统，从而表现出显著的抗白血病能力[6-8]。

在废弃基质利用方面，秀珍菇可利用农业剩余物进行固态发酵，尤其对小麦秸秆中的木质素和纤维素有较强的降解能力[9]，因此可以考虑在栽培基质中用农业剩余物替代部分或全部木屑，如此可以有效缓解菌林矛盾；在工厂化生产中，秀珍菇在对比其他常见食用菌来说，孢子产出量少，不仅降低了工作人员患呼吸道疾病的风险，又能有效减少食用菌栽培设施的损耗[10]；在降解有害物质方面，秀珍菇可通过固体发酵去除木材中残余的五氯酚，去除土壤中的工业油料，并对工业染料进行脱色[11-14]。

国内外对于农业废弃物栽培秀珍菇的研究鲜有报道，因此研究具有一定的创新性，为秀珍菇“以草代木”设施化栽培提供理论基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

秀珍菇编号：CCMJAU 201708（吉林农业大学食药用菌工程研究中心提供）。

1.1.2 供试材料

小麦秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆、玉米芯、花生秸秆、水稻秸秆、大豆秸秆、杨木屑、棉籽壳、麦麸、生石灰，PDA培养基：200 g马铃薯、20 g葡萄糖、20 g琼脂、1 L蒸馏水，pH=7.0。

1.1.3 试验仪器

BKQ-Z751立式压力蒸汽灭菌锅、SCB-1820超净工作台、BSP-250生化培养箱、Bio Tek多功能酶标仪。

1.2 试验方法

1.2.1 初筛培养基的制备

分别称取7种农业剩余物各25 g，替代对照配方[15]（木屑40%，棉籽壳39%，麦麸20%，生石灰1%）中的木屑和棉籽壳，其他辅料成分不变，等量分装于5个平板（直径100 mm）中，含水量78%，121℃高压灭菌40 min，冷却至室温备用。

1.2.2 混合设计配方

利用单纯型格子法，采用多项式二次方程拟合Scheffe模型，将响应变量（Y）与自变量（X）进行关联，对研究进行配方设计[16]，根据实验经验设定自变量取值范围，设计出如下10个配方（表1）：

表1 培养料配方设计Table1 Design of substrates formula

0%≤X1≤100%

0%≤X2≤100%

0%≤X3≤100%

X为主料，主料成分占整个培养基的79%，其余辅料麦麸、生石灰占21%。X1+X2+X3=100%。对照配方[15]：木屑40%，棉籽壳39%，麦麸20%，生石灰1%。

1.2.3评价指数

试验测定了秀珍菇菌丝生长时期的5个评价指数：菌丝生长速率、纤维素酶酶活、多酚氧化酶酶活、漆酶酶活和蛋白酶酶活。漆酶、多酚氧化酶、蛋白酶酶活的测定参照韩增华等[17]的方法。纤维素酶酶活的测定参照安琪等[18]的方法。

2 结果与分析

2.1 初筛结果

通过对7种农业剩余物的筛选实验，结果表明，不同农业剩余物基质的菌丝生长速率之间存在显著性差异（P＜0.05）（图1）。大豆秸秆培养基的菌丝生长速率最高（3.50 mm·d-1），并显著高于对照组（3.39 mm·d-1），其次是小麦秸秆和玉米秸秆，分别为3.27 mm·d-1和3.00 mm·d-1。水稻秸秆和花生秸秆培养基菌丝生长速度最慢，以此为依据，选择大豆秸秆、小麦秸秆和玉米秸秆作为适宜的主料基质，进行下一步配方设计。

图1 初筛配方秀珍菇菌丝生长速率差异显著性分析Fig.1 Analysis on the difference of growth rate of mycelium of Pleurotus pulmonarius with initial screening formula

2.2 各评价指数数据统计分析

2.2.1 秀珍菇菌丝生长速率

菌丝生长速率与各主料之间的回归方程如下：

Y=3.87X1+3.76X2+3.27X3-1.78X1X2-1.57X1X2-0.046X2X3+1.79X12X2X3-92.21X1X22X3+73.38X1X2X32

结果表明，二次多项回归模型和线性混合模型的P值均呈极显著水平（表2）。相关系数R2=0.990 6，表明回归模型与菌丝生长速率数据有99.06%的符合度，很好的拟合了三种农业剩余物与菌丝生长速率之间的关系。如图2所示，所有数据点均集中分布在斜线周围，表明菌丝生长速率的实测值与预测值拟合较好。方程中自变量的系数K反映了方程中自变量的影响程度，即贡献程度[19]。回归方程系数K（X1）＝3.87＞K（X2）＝3.76＞K（X3）＝3.27，表明这三种农业剩余物做主料对菌丝生长速率的贡献程度如下：小麦秸秆＞玉米秸秆＞大豆秸秆。交互作用X1X2、X1X3、X1X22X3、X1X2X32是极显著的（表2），表明小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆三者间的交互作用可显著影响菌丝生长速率。图3是三种主料交互作用下的菌丝生长速率3D视图，颜色越趋于红色表明数值越高，颜色越趋于蓝色表明数值越低。由图3可看出，交互作用X1X2、X1X3和X1X22X3可显著降低秀珍菇的菌丝生长速率，交互作用X1X2X32可显著增高秀珍菇的菌丝生长速率。

图3 小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆对菌丝生长速率影响的3D视图Fig.3 3D view of the effect of wheat straw，corn straw，and soybean straw agro-residues on mycelia growth rate

表2 菌丝生长速率的二次多项回归模型方差分析Table 2 Variance analysis of the quadratic polynomial regression model for mycelium growth rate

图2 预测值与实际菌丝生长速率之间的线性相关图Fig.2 Linear correlation plot between the predicted and actual values for mycelia growth

2.2.2 秀珍菇多酚氧化酶活性分析

多酚氧化酶活性与各主料之间的回归方程如下：

Y=3.59X1+2.45X2+3.16X3+18.66X1X2-5.30X1X3+10.84X2X3-17.19X12X2X3-321.55X1X22X3+69.12X1X2X32

多酚氧化酶是一种引起食用菌子实体酶促褐变的酶类，但在菌丝生长阶段，其活性越高表明菌丝降解基质的能力越强，所以多酚氧化酶活性是可以显示出菌丝活力强弱的重要因素。由表3可知，两种模型的P值均呈极显著水平。相关系数R2=0.970 2。11个配方的所有数据均匀集中分布在一条线上，表明秀珍菇多酚氧化酶活性的实测值与预测值拟合较好（图4）。回归方程系数K（X1）＝3.59>K（X3）＝3.16>K（X2）＝2.45，表明这三种农业剩余物做主料对多酚氧化酶活性的贡献程度如下：小麦秸秆>大豆秸秆>玉米秸秆。交互作用X1X2、X1X3、X2X3、X1X22X3、X1X2X32是极显著的（表3），表明三者间的交互作用可显著影响多酚氧化酶活性。由图5可看出，交互作用X1X2、X1X3和X2X3可显著提高多酚氧化酶活性，交互作用X1X22X3、X1X2X32可显著降低多酚氧化酶活性。

图4 预测值与实际多酚氧化酶活性之间的线性相关图Fig.4 Linear correlation plot between the predicted and actual values for activity of polyphenol oxidase

图5 小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆对多酚氧化酶活性影响的3D视图Fig.5 3Dview of the effect of wheat straw，corn straw，and soybean straw agro-residues on activity of polyphenol oxidase

表3 多酚氧化酶的二次多项回归模型方差分析Table 3 ANOVA for fitted quadratic polynomial model of polyphenol oxidase activity

2.2.3 秀珍菇纤维素酶酶活测定结果

纤维素酶活性与各主料之间的回归方程如下：

Y=24.17X1+8.89X2+11.71X3-15.07X1X2+23.54X1X3+3.83X2X3-740.48X12X2X3-15.57X1X22X3+83.21X1X2X32

农业剩余物基质中含有大量纤维素，纤维素酶是食用菌菌丝降解纤维素的关键酶，纤维素酶活性越高，菌丝降解纤维素能力越强。两种模型的P值均呈极显著水平，拟合度较好（表4）。相关系数R2=0.990 8。11个配方的所有数据均匀集中分布在一条线上，表明纤维素酶活性的实测值与预测值拟合较好（图6）。回归方程系数K（X1）＝24.17>K（X3）＝11.71>K（X2）＝8.89，表明小麦秸秆对纤维素酶活性的贡献程度最大，其次是大豆秸秆和玉米秸秆。交互作用X1X2、X1X3、X2X3、X1X2X3、X1X2X32是极显著的（表4），表明三者间的交互作用可显著影响多酚氧化酶活性。由图7可看出，交互作用X1X3、X2X3和X1X22X3可显著提高纤维素酶活性，交互作用X1X2和X12X2X3可显著降低纤维素酶活性。

图6 预测值与实际纤维素酶活性之间的线性相关图Fig.6 Linear correlation plot between the predicted and actual values for activity of cellulase

图7 小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆对纤维素酶活性影响的3D视图Fig.7 3D view of the effect of wheat straw,corn straw，and soybean straw agro-residues on activity of cellulase

表4 纤维素酶活性的二次多项回归模型方差分析Table 4 ANOVA for fitted quadratic polynomial model of cellulase activity

2.2.4 秀珍菇漆酶活性分析

漆酶活性与各主料之间的回归方程如下：

Y=5.79X1+5.17X2+6.74X3+57.00X1X2+25.22X1X3+19.05X2X3-216.04X12X2X3+44.99X1X22X3-292.61X1X2X32

漆酶是降解木质素的关键酶，在食用菌菌丝生长过程中起着至关重要的作用，因此漆酶活性也是判断菌丝活力大小的一个重要依据。相关系数R2=0.991 6。11个配方的所有漆酶活性数据均匀集中分布在一条线上，表明漆酶酶活的实测值与预测值拟合较好（图8）。回归方程系数K（X3）＝6.74>K（X1）＝5.79>K（X2）＝5.17，表明大豆秸秆对漆酶活性的贡献程度最大，其次是小麦秸秆和玉米秸秆。交互作用X1X2、X1X3、X2X3是极显著的（表5），表明三者间的交互作用可显著影响漆酶活性。由图9可看出，交互作用X1X2、X1X3、X2X3均可显著提高漆酶活性。

图8 预测值与实际漆酶活性之间的线性相关图Fig.8 Linear correlation plot between the predicted and actual values for activity of laccase

图9 小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆对漆酶活性影响的3D视图Fig.9 3D view of the effect of wheat straw，corn straw，and soybean straw agro-residues on activity of laccase

表5 漆酶的二次多项回归模型方差分析Table 5 ANOVA for fitted quadratic polynomial model of laccase activity

2.2.5 秀珍菇蛋白酶活性分析

蛋白酶活性与各主料之间的回归方程如下：

Y=0.18X1+0.16X2+0.17X3+0.021X1X2+0.016X1X3+0.047X2X3+2.26X12X2X3-2.87X1X22X3-0.039X1X2X32

蛋白酶是当基质中氮源不足时，菌丝分泌出来充当氮源的一种酶类，所以蛋白酶活性高，表明基质中氮源过少，不利于菌丝生长。根据表6可知，两种模型的P值均呈极显著水平，拟合度较好。相关系数R2=0.875 3。11个配方的所有蛋白酶活性数据均匀集中分布在一条线上，表明蛋白酶酶活的实测值与预测值拟合较好（图10）。回归方程系数K（X1）＝0.18>K（X3）＝0.17>K（X2）＝0.16，表明小麦秸秆对蛋白酶活性的贡献程度最大，其次是大豆秸秆和玉米秸秆。交互作用X2X3、X12X2X3、X1X22X3是极显著的（表6），表明三者间的交互作用可显著影响蛋白酶活性。由图11可看出，交互作用X2X3、X12X2X3可显著提高蛋白酶活性，X1X22X3可显著降低蛋白酶活性。

图10 预测值与实际蛋白酶活性之间的线性相关图Fig.10 Linear correlation plot between the predicted and actual values for activity of protease

图11 小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆对蛋白酶活性影响的3D视图Fig.11 3D view of the effect of wheat straw，corn straw，and soybean straw agro-residues on activity of protease

表6 蛋白酶的二次多项回归模型方差分析Table 6 ANOVA for fitted quadratic polynomial model of protease activity

2.2.6 配方预测

利用单纯型格子法中Optimization功能，设定菌丝生长速率、多酚氧化酶、漆酶、纤维素酶和蛋白酶期望响应值，优化出1个适合秀珍菇菌丝体生长的农业剩余物配方：小麦秸秆61.4%，玉米秸秆17.6%，麦麸20.0%，石灰1.0%。下一步进行配方验证，看预测出的配方是否适合秀珍菇菌丝培养。

2.2.7 验证试验

将预测出的最优配方与对照配方共同进行一次平板实验，测定菌丝生长速率、多酚氧化酶酶活、纤维素酶酶活、漆酶酶活和蛋白酶酶活，验证结果如表7所示：5种评价指标均显著优于对照配方，因此，农业剩余物配方可以替代对照配方进行秀珍菇菌丝培养。

表7 验证试验结果分析Table 7 Analysis of test results

3 讨论

木腐菌草腐化已逐渐成为我国食用菌产业发展趋势，虽然利用农业剩余物进行食用菌栽培的研究很多，但是利用单纯型格子法进行优化却鲜有报道。单纯型格子法是混料设计方法，通过回归分析，可知不同农业剩余物间的交互作用对菌丝生长速率和各种酶活的影响[19]。因此，研究以7种不同农业剩余物（小麦秸秆、水稻秸秆、大豆秸秆、玉米秸秆、玉米芯、花生秸秆、油菜秸秆）为研究对象，通过初筛，筛选出小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆等三种农业剩余物进行配方设计，最终设计出10个配方。

建立这10个配方对菌丝生长速率、多酚氧化酶酶活、纤维素酶酶活、漆酶酶活和蛋白酶酶活的统计模型。经过数据分析，三种农业剩余物单独做主料时，小麦秸秆基质的菌丝生长最快，其次是玉米秸秆和大豆秸秆。这与吴楠等[20]研究的不同农业剩余物对红平菇影响结果相似。在酶活方面，三种农业剩余物单独做主料时，纤维素酶活性最高的是小麦秸秆，其次是大豆秸秆；漆酶活性最高的是大豆秸秆，其次是小麦秸秆。造成这种结果可能是因为这三种农业剩余物的营养成分如纤维素、木质素含量不同[21]。经查阅文献可知，小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆的纤维素含量分别为39.26%、37.15%和30.83%，木质素含量分别为22.10%、22.14%和32.80%[22]，所以小麦秸秆纤维素含量最高，大豆秸秆木质素最高。由此结果可说明，基质中纤维素和木质素含量是影响纤维素酶酶活和漆酶酶活的重要因素。

三种农业剩余物共同作用时，4号配方多酚氧化酶和漆酶活性最高，1号配方和5号配方纤维素酶活性最高，8号配方蛋白酶活性最低，以上结果表明，几种农业剩余物共同作用比单独作用对几种重要酶活的影响更显著。推测造成这种结果是由于不同基质的C/N不同。C/N的差异也是影响食用菌评价指标的重要因素之一。小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆的碳氮比分别为70.92、39.30和75.03[22]。小麦秸秆在菌丝生长速率、多酚氧化酶酶活和纤维素酶酶活3个方面的贡献率最大，由此说明小麦秸秆是一种适合秀珍菇菌丝培养的农业剩余物。如果在小麦秸秆的基础上，添加适量玉米秸秆，将更有利于秀珍菇菌丝生长。