李世念，刘婉宁，丁重阳，王金涛

（黑龙江八一农垦大学大学动物科技学院，大庆 163319）

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性、热性、高度致死性传染病[1]。PRV属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）、猪疱疹病毒I型（Suidherpesvirus）。该病最早报道于1813年美国发现有牛死于瘙痒，1902年Aujeszky率先分离出伪狂犬病毒，1935年Shope发现猪对本病传播有重要影响，1947年我国在猫中分离到该病毒。伪狂犬病毒是家畜病原中重要的神经系统病原体，可感染哺乳动物、反刍动物、啮齿动物和食肉动物[2]。其中猪作为本病毒的主要宿主和传染源，是唯一种能够在PRV感染后存活，一旦感染便终生带毒、排毒；且病猪、带毒猪既可通过直接或间接接触在猪群中形成水平传播，又可通过公猪精液和母猪胎盘侵害胎儿形成垂直传播[3]。不同阶段的猪感染后临床症状并不相同，如妊娠母猪会发生流产、死胎、弱产子；适龄母猪不育、返情率高；育肥猪一般为发热、出现生长迟缓；仔猪突然发病，体温升高，精神极度萎靡、发抖、运动不协调、痉挛、呕吐、腹泻、常出现神经症和呼吸道症状，致死率高达100%[4]。另外，该病毒还会破坏机体免疫系统，致使机体免疫能力低下，从而引起其他传染病的继发[5]。

由于其高致死率，对猪场经济效益造成了严重损失，因此规模化猪场主要采取注射猪伪狂犬gE基因缺失弱毒疫苗进行预防。根据这种预防为主的策略，我国在猪伪狂犬病防控方面已经取得良好的效果。但随着我国养猪业的发展壮大，规模化猪场仍存在免疫程序不合理，免疫效果不明确，养殖环境呈现恶化的趋势，使得该病始终是危害猪群健康的主要疫病之一[6]。现有的研究表明，该病毒还呈现遗传变异，导致一些已接种了伪狂犬病毒疫苗的猪场，依然爆发该病[7]。基于此，笔者所在课题组为了解黑龙江省某规模化猪场的猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫情况，于2020年四月份和七月份两次随机采集该规模化猪场不同阶段猪只血清共395份，进行了猪伪狂犬病病毒gE和gB抗体的检测与对比分析。旨在探究该场猪伪狂犬病免疫程序的合理性，明确免疫效果，进而为该场猪伪狂犬病的防控提供参考数据与合理性建议。

1 材料与方法

1.1 免疫程序

该规模化猪场母猪存栏1 200头，基础猪群每年进行3次免疫，每头猪肌注2头份；仔猪及育肥猪在70 、100日龄各免疫一次，每头猪肌注2头份。

1.2 样品采集

两次用于检测的395份血清样本均来自该规模化猪场。具体方法为使用一次性采血器在猪前腔静脉采集血液样品3～5 mL，采血部位示意图如图1所示。

图1 血清采集部位示意图（图片引自李峰论文[8]）Fig l Schematic of sites used in serum collected

1.3 血清样品

血清按照猪群比例随机采集，室温静置，待血清自然析出或离心后将其移至1.5 mL离心管内，并按照不同阶段对其编号后-20℃冷冻保存备用，采血分布情况如表1和表2所示。

表1 四月份采集血清分布情况Table 1 Distribution of serum collected in April

表2 七月份采集血清分布情况Table 2 Distribution of serum collected in July

1.4 主要设备与仪器

MULiskan Go自动酶标仪，购自美国Bio Tek仪器有限公司；303A-4恒温培养箱，购自北京光明医疗仪器厂；单道及多道微量移液枪，购自美国eppendorf公司；台式冷冻离心机，购自美国Thermo公司；DNX-9620洗板机，购自上海沪粤明科学仪器有限公司；Easypure IIRF便携式超纯水系统，购自北京宏昌信科技有限公司；猪伪狂犬病病毒gE和gB抗体检测试剂盒，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司。

1.5 实验前的准备

取出保存在4℃冰箱内的猪伪狂犬病病毒gE和gB抗体检测试剂盒，室温下静置1～2 h，10倍浓缩洗涤液需要用蒸馏水或去离子水进行稀释。

1.6 PRV-gE与PRV-gB抗体ELISA检测操作流程

（1）用样品稀释液把待测样品做2倍稀释；（2）取出抗原包被板，并在登记表上备注样品放置的位置；（3）在2到3个适当的孔中加入100μL，并以1∶2的稀释比例进行阴性对比；（4）在2个适当的孔中加入100μL稀释成1∶2的比例进行阳性对比；（5）在剩余的孔中各自加入100μL稀释过的待检测的样品；（6）把血清或血浆样品放置在室内环境下，孵育1小时；（7）摇动微孔板孔中的液体，用300μL洗涤液进板孔冲洗，反复冲洗3～5次。每次清洗都应甩掉孔中的液体，最后一次操作之后，将孔固定在吸水纸表面，吸净表面液体；（8）在每孔中加入酶标记的抗体100μL，放在室温环境下，孵育20 min；（9）将步骤7再次重复；（10）在每个孔中加入100μL TMB底物溶液，放置在18～26℃的环境下，放置15 min，注意需要避光进行；（11）在每个孔中加入50μL终止溶液终止反应；（12）借助酶标仪读取样品及对比样品650 nm处的吸光光度值。

1.7 结果判定

PRV-gE与PRV-gB抗体ELISA检测结果的判定标准相同，阴性对照OD650平均值-阳性对照OD650平均值≥0.30，即说明检测有效；S/N=待检样本OD650/阴性对照OD650均值，当S/N值≤0.60，判定为样品抗体阳性；当S/N值＞0.70，判定为样品抗体阴性；当0.60＜S/N值≤0.70，判定为样品可疑，需要重测。

1.8 注意事项

（1）试剂盒使用前各试剂应平衡至室温，使用后放回4℃冰箱；（2）检测板拆封后避免受潮或沾水；（3）不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用试剂时应防止试剂污染；（4）本次待检血清样品数量较多，应先使用血清稀释板稀释完所有待检测血清，再将稀释好的血清转移到检测板，使反应时间一致；（5）浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释，如果发现有结晶应加热使其溶解后再使用；（6）严格操可以得到比较好的结果，因此实验全过程中的移液，定时和洗涤等必须精确进行。

2 结果与分析

2.1 猪伪狂犬病病毒gE抗体的检测和分析

由表3可与表4可知，对两次随机采集的245份和120份血清样品分别进行了猪伪狂犬病病毒gE抗体检测，发现该场所有被检猪只均未检测出PRVgE抗体。基础猪群、仔猪及保育育肥猪抗体平均值相对统一，离散度相对较小。说明猪场现阶段没有感染过猪伪狂犬病毒，应继续保持本场现有的生物安全防疫措施。

表3 4月份PRV-gE抗体ELISA检测结果Table 3 Results of PRV-gE antibody ELISA in April

表4 7月份PRV-gE抗体ELISA检测结果Table 4 Results of PRV-gE antibody ELISA in July

2.2 猪伪狂犬病病毒gB抗体的检测和分析

由表5和表6可知，对两次随机采集的245份和150份血清样品分别进行了猪伪狂犬病病毒gB抗体检测，发现该场基础猪群猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性率相对理想，抗体平均值稳定，能够为猪群提供保护。3周龄仔猪gB抗体阳性率均为100%，说明此阶段母源抗体保护力极好。4月份检测中8周龄保育猪时gB抗体阳性率降低为25%，抗体平均值达到0.724，说明此阶段猪只几乎无保护作用。两次检测中育肥猪各阶段随着猪只周龄的增加，猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性率逐渐升高，其中4月份在12周龄育肥猪60%、16周龄育肥猪74%，20周龄育肥90%，育肥猪整体抗体平均值维持在0.451；7月份在16周龄育肥猪80%，22周龄育肥猪93%，育肥猪整体抗体平均值维持在0.329，两次检测结果说明猪只在历经70日龄和100日龄疫苗免疫后猪群抗体水平逐渐升高，进而为机体提供保护。

表5 4月份PRV-gB抗体ELISA检测结果Table 5 Results of PRV-gBantibody ELISA in April

表6 7月份PRV-gB抗体ELISA检测结果Table 6 Results of PRV-gB antibody ELISA in July

3 讨论

由于猪伪狂犬病具有潜伏感染，死亡率高，致病性强等特点，在很大程度上限制了我国猪场规模化养殖模式的发展，故使得该病一直都是研究热点。这些年来我国通过免疫接种，野毒监测及净化等技术手段，已经使该病在猪群中得到有效控制。但是自2011年起，猪伪狂犬病再次在我国河北和山东等养殖密度较大的地区暴发流行，随后疫情蔓延至我国多地，许多规模化猪场都不同程度上出现了传统疫苗免疫失败的情况[9]。具体表现为接种过传统疫苗的猪群再次表现出疑似猪伪狂犬病的临床症状，感染猪的发病率和死亡率呈明显上升趋势。经相关毒力基因测序表明新的猪伪狂犬病病毒变异株抗原性已发生变异分属于一个独立的分支，变异株属于基因II型，而传统毒株属于基因1型。变异株与经典强毒株相比，猪伪狂犬病病毒变异株引起的临床症状更明显、致死率更高、传播速度更快、呈现出毒力增强的趋势[10]，增加了疫情的复杂化以及猪群的病死率。

因此大量研究人员对我国不同省份的猪伪狂犬病病毒展开相关研究，报道了我国华南、华北、华东等地猪伪狂犬病病毒基因变异，毒力在发生改变的相关情况。如石远菊等[11]对猪伪狂犬病病毒贵州部分流行株的gE基因突变中发现gE基因核苷酸序列存在很多碱基替换；左玉柱等[12]对河北省猪场伪狂犬病病毒感染情况调查及gE基因遗传变异分析中发现，河北省近几年流行的猪伪狂犬病病毒主要为毒力增强的变异毒株；孟帆等[13]对猪伪狂犬病病毒山西分离株gE全基因的遗传变异多样性及流行特点分析中得出，山西猪伪狂犬病病毒gE基因发生了一定程度的变异；刘杰等[14]研究表明中国伪狂犬病病毒新变种的广泛重组和种间快速传播。面对猪伪狂犬病的现状，冯哲[15]提出规模化猪场可采取活疫苗加死疫苗的免疫防控策略，但方法无法解决规模化猪场潜在感染问题，且耗时耗力，所以并不被广泛适用，目前全球养猪业领域主要采用猪伪狂犬病病毒gE基因缺失活疫苗，并配套有猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒，试剂盒对猪伪狂犬病病毒抗体极其敏感，非常微量的抗体水平就能够产生准确的结果[16]。同时基因缺失疫苗与传统灭活苗相比，其优势也比较明显，优势主要表现在基因缺失疫苗稳定、不易发生毒力返祖增强、PRV基因缺失株毒力低但免疫原性强、保护时间长[17]。随着基因缺失疫苗的研究和应用，通过对免疫程序、免疫方式、免疫佐剂等的改变，结合血清学抗体检测技术和野毒鉴别技术，可用于疫苗免疫猪群与自然感染猪群的鉴别诊断[18]，从而判断猪场伪狂犬病野毒感染情况。

从试验来看，规模化猪场也采取接种猪伪狂犬病病毒gE基因缺失活疫苗的方法，同时在两次检测中各阶段猪只猪伪狂犬病病毒gE抗体检测阳性率均为0，说明该场现阶段并无猪伪狂犬病野毒感染的发生，且4月份和7月份两次检测猪只猪伪狂犬病病毒gE抗体平均值均显著高于试剂盒0.6的判断标准，这也说明该猪场伪狂犬病防控效果较为理想，应继续推进相关防疫措施的落实，以保证防疫效果稳定的状态。因两次检测的各阶段猪只血清gE抗体阳性率为0，所以gB抗体检测结果更能评估该规模化猪场的猪伪狂犬病的免疫状况。从两次对该规模化猪场gB抗体检测检结果来看，基础猪群猪伪狂犬病病毒gB抗体阳性率维持在较高水平，抗体平均值相对均一，说明该猪场基础猪群伪狂犬疫苗免疫效果良好，但免疫后一个月的效果略好于免疫后两个月；3周龄仔猪时，gB抗体阳性率均为100%，4月份8周龄保育猪、12周龄育肥猪、16周龄育肥猪、20周龄猪育肥猪gB抗体的阳性率分别为25%、60%、74%、90%；7月份gB抗体的阳性率分别为16周龄育肥猪80%，22周龄育肥猪93%；两次检测结果均表明经过两次免疫后机体能够产生较好的免疫应答，抗体水平显著上升，进而为机体提供保护。根据阳性率再结合表5与表6中列出的抗体平均值可看出保育育肥猪只gB抗体阳性率和平均值出现了较为明显的波动，这与杨依波[19]报道的不同日龄猪伪狂犬病毒抗体检测阳性率始终维持在100%，抗体平均值均一、整齐的结果并不一致。3周龄时，母源抗体水平较理想，保护效果好，8周龄时母源抗体大幅降低，疫苗对保育猪几乎无保护，这与2016年王金涛等[20]对辽宁省某规模化猪场猪伪狂病的检测中gB抗体阳性率在12、15周龄大幅下降的结果也不一致，因此规模化猪场应结合猪场实际情况，查明导致8周龄猪只gB抗体大幅下降的原因，同时应增加8周龄前后猪只的采血检测，确定母源抗体的维持时间，从而确定猪只的首免日龄，制定出更加合理的免疫程序和防疫措施，以降低该周龄段猪群被感染的几率。

面对猪伪狂犬病的现状，有研究人员对新出现的PRV变异株进行了进一步的研究，已制备出PRV-gB和PRV-gE的单克隆抗体[21-22]。有望建立广泛适用的评价疫苗免疫效果的抗体ELISA试剂盒，并为抗病毒药物设计和疫苗研发提供指导，当然这还需要一定的时间。因此规模化猪场想要摆脱猪伪狂犬病的威胁，除了制定完善的免疫程序与疫苗评估体系外，还应加强饲养管理和消除传播媒介等几个方面着手[23]。首先要基于猪场具体的检疫情况制定合理的免疫程序，通常以猪场阳性率10%作为临界水平，阳性率高于10%时一般采取密集免疫形式，低于10%时采取一般免疫形式。同时定期对猪群PR阳性率进行监测，并根据监测结果及时调整免疫程序，根据毒株流行情况指导疫苗选择[24]，对于疑似隐性带毒猪要制定合理的免疫方案并严格按照免疫程序执行。同时利用ELISA法检测猪群抗体水平掌握猪群潜伏感染情况，对于阳性猪，隐性带毒猪一律采取淘汰，扑杀的处理方式，从源头上阻断PRV的感染和传播。同时加强饲养管理，基于饲养标准针对猪群制定科学合理的饲养方案[25]，满足机体的营养需求。同时营造干净卫生的饲养环境，对猪舍进行定期消毒以预防病原传播，消毒时以多种消毒药物交替使用为宜。消除传播媒介对于PRV感染的防控同样重要，规模化养猪场要构建一套适用于猪场自身条件的生物安全体系，根据猪种类的不同实行分群饲养对进入猪场的车辆和人员进行严格消毒。另外鼠类作为PRV的主要带毒者和传播媒介应给予高度重视。在做好定期灭鼠工作的同时也要注意饲料保存，避免用于投喂的饲料被鼠代谢物污染。并处理好病死猪，以及动物粪便，对种猪和仔猪都要进行定期免疫，对于繁育猪和育肥猪，外来引进猪群要进行定期血清学检测，做到对感染情况的及时管控，从而阻隔猪伪狂犬病的蔓延。

4 结论

综上所述，该规模化猪场各阶段猪只伪狂犬病病毒gE抗体检测阳性率均为零，猪场基础猪只伪狂犬病病毒gB抗体阳性率较理想，虽然8周龄保育猪gB抗体阳性率较低，感染风险较大，但是经过两次免疫后抗体水平逐渐上升，并对机体提供了保护。