贺鑫梅，王媛，冯耀元，毛莹莹，邢晓娅，向虹怡，郭晓宇，韩英浩，金美华

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是一类含氧物质，化学性质十分活泼，并且具有很强的氧化能力，是细胞代谢中的一种不可避免的产物[1]，包括超氧阴离子自由基、羟基自由基以及过氧化氢等[2]。细胞内ROS的产生以及清除处在一种动态平衡，当一些外界的因素以及自身原因打破这一平衡时，大量的ROS积累，造成DNA的损伤、蛋白质的氧化和脂质过氧化，破坏细胞的结构和功能[3]。根据ROS的来源、细胞类型以及组织环境不同，ROS信号可能导致代谢功能障碍和炎症反应的发生，进而导致相关疾病，如酒精性肝病、动脉粥样硬化、糖尿病和中风等的发生[4-8]。

肝脏是人体重要的解毒器官，是各种药物、化学物质代谢的场所，肝脏在代谢物质时产生的过量ROS，损害肝细胞的结构和功能，造成肝内脂肪积累和炎症反应的发生，严重危害人体健康。为了抵抗代谢过程中产生的过量ROS，肝脏内有超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽等酶及维生素A和维生素C等抗氧化剂清除ROS[9]。除了以上经典的抗氧化酶和抗氧化剂外，Peroxiredoxins（Prxs）蛋白是一类具有抗氧化作用的蛋白家族，广泛存在于抗氧化防御和氧化还原信号通路中，此外在真核生物以及原核生物中普遍存在[10]。根据Cys残基的位置和数目可分为2-Cys（Prx I-Prx IV）、非典型2-Cys（Prx V）和1-Cys（Prx VI）[11]。Prxs蛋白家族含有的活性半胱氨基位点能够氧化H2O2，以此将细胞中多余的ROS清除，使细胞受到保护，不被损伤[12]。而PrxⅡ作为Prxs家族的一员，可将H2O2还原成水，并在氧化应激的条件下表达上调以清除细胞内多余的ROS[13-15]。

慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒改造而成，是一种高效的基因转导工具，它能够将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞，并可在宿主体内长期表达，不易诱发宿主免疫反应，是基因功能研究和基因治疗中一种不可多得的优良的载体[16-18]。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。它本身是生物进化过程中细胞的一种保护性机制，机体可因此避免外源性基因（如病毒、转座子）在宿主细胞内表达，清除一些生命发育过程中出现的异常mRNA。如今，已经把它作为沉默目的基因表达的一种有效手段。慢病毒介导的RNAi技术与传统基因敲除技术相比，能够获得更加稳定的基因敲降效果，是用于研究某个特定基因功能的理想方法[16-20]。

利用慢病毒载体将Prx II基因特异性ShRNA转入人肝细胞系QSG-7701，利用嘌呤霉素进行筛选获得Prx II敲降的稳定细胞系，并对细胞处理不同浓度的H2O2，以研究缺失Prx II后对肝脏细胞抗氧化性的影响。同时，Prx II敲降的稳定细胞系的建立也为进一步研究该蛋白的生物学功能提供了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人肝细胞系QSG-7701（由黑龙江八一农垦大学分子病理与药效学实验室提供）。

1.1.2 药品与试剂

DMEM（Hyclone公司），FBS（Gibico公司），P/S（Gibico公司），TE（北京Solarbio），Hank’s洗液（Hyclone公司），Prx II空白慢病毒载体（上海吉玛基因），Prx II敲降慢病毒载体（上海吉玛基因），puromycin dihydrochloride（Gene Operation），MTT（Amreso），DMSO（天津市富宇试剂），H2O2（西格玛公司），PBS（Hyclone公司），Prx II抗体（Abfrontier），βactin抗体（博奥森生物）。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒质粒的构建

慢病毒载体是以国际通用的第三代载体为基础，通过上海吉玛基因的改建，构成四质粒体系，如图1，将其删除了全部HIV-1的编码基因，所以在介导目的基因的表达时，没有任何HIV-1蛋白的表达，而且对5’和3’LTR分别进行了删除改造，5’LTR缺失U3，换上RSV promoter，使载体的复制不再依赖Tat，3’LTR删除U3，使其不再具有启动活性，成为自灭活（self-inactivating，SIN）载体。

图1 慢病毒质粒图谱Fig.1 Lentivirus plasmid profile

1.2.2 病毒滴度测定

将处于对数生长期的293T细胞以3×104个细胞/孔的浓度接种于96孔板，37℃，5%CO2培养箱培养24 h。取10μL待测定的病毒原液，用含10%FBS培养液十倍稀释3～5个梯度。次日，吸弃96孔板的培养液，每孔加入100μL稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37℃，5%CO2培养箱培养，24 h后，吸弃96孔板中的病毒液，每孔加入100μL 10%FBS的DMEM培液，于37℃，5%CO2培养箱继续培养72 h。期间每隔24 h进行换液。通过荧光显微镜计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度，用TU·ml-1（感染单位/毫升）表示。

1.2.3 慢病毒转染细胞

将生长状况良好的细胞，以每毫升3.5×105个的密度种到6孔板，分为3组（标记为Blank，Scramble，Sh-Prx II）。第二天，对三组细胞进行换液，并根据预先测定的MOI值（MOI值为4.6）向Scramble和Sh-Prx II里面分别加入适量的空白载体病毒液和慢病毒液，进行培养。第三天，观察生长状况，将三组细胞进行1∶2传代，传到六孔板，每组各种两个孔板。第四天，弃去培养液，更换为新的培养液，继续培养。第五天，将种于六孔板中的三组细胞的两个孔板合并，传至6 cm培养皿。第六天，细胞量增多，将细胞传到10 cm培养皿中，进行培养。第七天，更换新的培养液，继续培养。第八天，将三组细胞1∶2传代至两个10 cm培养皿，进行培养。第九天，三组细胞更换新培养液，使用2μL（10 mg·mL-1）嘌呤霉素处理，筛选出转染细胞，当Blank细胞全部死亡后，弃去培养液，更换为新的培养液。将细胞传代至3.5 cm培养皿中，继续培养24 h。

1.2.4 流式细胞术检测转染效率

将生长状态良好的细胞从培养皿中使用胰蛋白酶/EDTA溶液（Trypsin/EDTA，TE）处理后，将细胞从培养皿中转移到1.5 mL的离心管中，3 000 r·min-1离心5 min，弃去培养液，PBS清洗两遍，3 000 r·min-1离心5 min，弃去上清，每个离心管加1 ml PBS，吹打混匀后，在BD公司的FACScalibur上进行数据采集，进行数据分析，作出结果图。

1.2.5 荧光照相检测转染效率

将生长状况良好的三组细胞TE处理后，离心，培养液吹打混匀，进行细胞计数。取三个1.5 mL的离心管，标记为Blank、Scramble、Sh-Prx II，每个加入160 mL的培养液，20 mL 0.4%台盼蓝溶液，20 mL对应的细胞悬液，混匀后于显微镜下进行计数，Blank、Scramble、Sh-Prx II三组细胞分别为32个、21个、22个。每个3.5 cm培养皿中种3×105个细胞，根据公式：（细胞计数/4）×104×稀释倍数（此处稀释倍数为10），计算出每个培养皿所需细胞悬液体积，将其均匀种于培养皿，37℃，5%CO2培养箱过夜培养。第二天，弃去培养液，PBS清洗一遍，荧光显微镜下检测发荧光的细胞数量，计算转染率。

1.2.6 蛋白质免疫印迹检测Prx II蛋白表达

①将Blank，Scramble，Sh-Prx II三组细胞用TE处理后，把细胞从培养皿中转移到1.5 mL的离心管中，3 000 r·min-1离心5 min，弃去培养液后，PBS清洗一遍，3 000 r·min-1离心5 min后，弃去上清。②在细胞球中加入120μL蛋白质裂解液，将离心管置于冰上，每5 min敲打一次，30 min后将离心管转移至离心机，12 000 r·min-1离心30 min。③离心结束后，将离心管转移至冰上，用200μL的移液枪吸取上清液，并将上清液转移至新的1.5 mL的离心管中。④取新的1.5 mL的离心管，向其中加入800μL的蒸馏水，200μL的考马斯亮蓝，1μL提取的总蛋白质样品后在震荡器上混匀，并用1 mL的移液枪将其转移至比色皿中，将比色皿放入分光光度计中，调节分光光度计的波长为595 nm，检测其OD值。⑤将检测的OD值代入蛋白质浓度的函数公式，计算出总蛋白质样品的蛋白质浓度。按照标准曲线计算出配制样品所需的蛋白、5×buffer、DDW所需体积，配制跑胶样品。配制完成后，在沸水中煮样5 min，煮完立即放进4℃冰箱。⑥配制SDS-PAGE的下层分离胶，分离胶的浓度是12%，凝固后配置SDS-PAGE的上层浓缩胶，浓缩胶的浓度是5%，待凝固后将SDS-PAGE移入电泳槽中，并向其中加入电泳液。⑦从4℃中取出样品，使用20μl的移液枪进行点样，样品每孔点15μL，蛋白maker每孔点2μL，电压140 V，电泳80 min左右。⑧跑胶结束后，4℃条件下，电流110 A过夜转膜，将分离后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后，取出硝酸纤维素膜，1%的丽春红进行染色，蛋白条带显色后，剪下所需的条带，TBST洗至液体没有红色。⑨5%的脱脂乳室温封闭1 h，TBST洗5次，每次5 min，加入1∶1 000的一抗进行目的蛋白的特异性免疫印迹，室温下2 h，再用TBST洗5次，每次5 min，加入5%的脱脂乳室温封闭10 min，1∶5 000的HRP标记的二抗室温孵育1 h。⑩ECL显影，利用荧光成像系统获得目的蛋白的条带。

1.2.7 细胞毒性检测

将生长状况良好的Scramble和Sh-Prx II，进行细胞计数，以每孔104个的细胞密度接种于96孔板，一 共 设 置6个 浓 度 梯 度（0、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25 mmol·L-1），每个浓度设置6个平行对照。37℃，5%CO2培养箱过夜培养。次日，吸弃培养液，加入含1%血清的培养液，饥饿处理2 h后，加入配置好的H2O2，1μL·孔-1，37℃恒温培养箱过夜培养。第二天，每孔加入10μLMTT溶液（5 mg·mL-1），继续培养，4 h后，弃去培养液，每孔加入100μL的DMSO，37℃下处理10 min，用酶标仪在490 nm处检测其吸光度值。根据公式：细胞存活率＝（实验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空白组OD值）×100%计算细胞的存活率。

1.2.8 统计学分析

2 结果与分析

2.1 流式细胞术检测慢病毒转染QSG-7701细胞的效率

为了确定慢病毒是否成功转染了QSG-7701细胞，对细胞进行了流式细胞术分析，Scramble组细胞、shPrx II组细胞转染率分别为98.80%、99.48%，如图2所示。

图2 流式细胞仪检测慢病毒转染QSG-7701细胞的效率Fig.2 FACSdetection of the efficiency of QSG-7701 cells transfected by the Prx II shRNA lentivirus

2.2 荧光照相检测慢病毒转染QSG-7701细胞的效率

为了进一步确定慢病毒对QSG-7701细胞的转染情况，对三组细胞进行了荧光照相，结果显示，在荧光视野下，Blank组的细胞无任何细胞发绿色荧光，Scramble组和Sh-Prx II组发绿色荧光的细胞数量占同一区域明亮视野下细胞量90%以上，如图3所示，表明90%的细胞被成功转染。

图3 荧光显微镜检测慢病毒转染QSG-7701细胞的效率Fig.3 Fluorescence microscope detection of the efficiency of QSG-7701 cells transfected by the Prx IIshRNA lentivirus

2.3 Prx II基因敲降结果验证

为了验证Prx II基因的敲降情况，将慢病毒转染后的QSG-7701细胞进行传代，之后进行蛋白免疫印迹实验，分别检测Blank，Scramble，Sh-Prx II三组的Prx II蛋白的表达情况，选用β-actin做内参。结果图4 A、B（**P＜0.01，*P＜0.05）显示，Sh-Prx II组的Prx II蛋白水平明显低于Blank组和Scramble组，表明成功构建了Prx II敲降的细胞系。

图4 蛋白免疫印迹检测慢病毒敲降QSG-7701细胞中Prx II的效果Fig.4 Expression level of Prx II in QSG-7701 by western blot

2.4 Prx II敲降后细胞的抗氧化作用下降

为了探究Prx II敲降后对QSG-7701细胞抗氧化性的影响，利用MTT assay检测不同浓度H2O2对Scramble组和Sh-Prx II组的细胞毒性。结果显示，在H2O2浓度大于0.15 mmol·L-1后，Sh-Prx II组的细胞存活率低于Scramble，如图5（**P＜0.01，*P＜0.05），表明在Prx II敲降后，细胞的抗氧化作用下降。

图5 MTT assay检测H 2O2对QSG-7701细胞中Prx II敲降后的存活率Fig.5 Detection of survival rate of H2O2 process QSG-7701 cells after Prx II knockout by MTT assay

3 讨论

Prx II是Prxs家族中的一员，具有抗氧化及清除自由基作用，参与细胞的增生和分化，细胞凋亡和细胞信号转导等功能。并且随着研究的深入，该蛋白家族的生理生化功能不断被发现，Prxs家族在多种肿瘤细胞中都高表达，与肿瘤之间的关系值得进一步探索[21-22]。近些年，Prxs家族在肝病中的保护作用被广泛研究，肝病分为酒精性肝病和非酒精性肝病，初期表现为脂肪肝，进而发展为肝炎，肝纤维化，严重时可导致肝硬化或肝癌的发生，是威胁人类健康的一大隐患。肝细胞内异常脂质代谢和过量ROS的产生引起的脂肪过量堆积将造成非酒精性脂肪肝的形成，Prx V过表达显著抑制了细胞质和线粒体ROS的产生，此外，Prx V调控AMP激活蛋白激酶通路和脂肪生成基因（固醇调控元件结合蛋白1和脂肪酸合成酶）的表达，抑制脂质积累，从而改善游离脂肪酸诱导的肝脏脂肪变性[23]。ROS被认为在酒精性脂肪性肝病中起重要作用，肝脂肪变性和随后的脂肪性肝病是酒精摄入的反应[24]。有研究表明酒精饲喂的小鼠中Prx I对ROS清除作用更强，Prx I对酒精喂养小鼠肝脏具有保护作用[25]。酒精喂养的Prx II基因敲除的小鼠和野生型小鼠，Prx II基因敲除的小鼠肝脂肪变性更加严重，表明Prx II对小鼠肝脏也有保护作用[26]。另外也有研究表明，Prx III通过清除活性氧来调节10号染色体上缺失的张力同源物（PTEN）的氧化还原，对酒精暴露时的脂肪生成具有拮抗作用[24]。

利用慢病毒载体介导Prx II基因特异性shRNA侵染人肝细胞系QSG-7701，通过流式细胞术以及荧光显微镜检测，结果显示，Scramble组细胞、shPrx II组细胞转染率分别为98.80%、99.48%，Scramble组和Sh-Prx II组发绿色荧光的细胞数量占同一区域明亮视野下细胞量90%以上，表明慢病毒成功转染细胞。之后对转染后的细胞进行蛋白免疫印迹检测，结果显示，与Scramble组对比，Sh-Prx II组Prx II蛋白的表达明显降低，表明获得了Prx II敲降的稳定细胞系。随后使用不同浓度的H2O2处理Scramble和Sh-Prx II两组细胞，MTT assay检测细胞毒性，结果显示，随着H2O2浓度增加，细胞的存活率显著下降，表明Prx II敲降后，QSG-7701细胞对H2O2的清除能力下降，即细胞的抗氧化作用受到了抑制。实验所采用的QSG-7701细胞系是目前与肝脏相关研究中运用较广泛的一种细胞系，因此构建Prx II敲降的QSG-7701细胞系为肝脏疾病的治疗提供技术支撑，并且初步探究Prx II对细胞抗氧化作用的影响，为后续阐明Prx II对肝细胞功能的调控作用提供新思路。