刘启嘉，杨宏志，，关键

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心）

我国每年农作物产量丰富，在发展秸秆的综合利用方面有较大潜力[1]，同时响应国家当下技术创新，减少石油、煤炭等高碳能源消耗[2]，每年理论上可以回收秸秆资源量高达7亿t以上[3]，然而秸秆表面以苯基丙烷为基本结构的天然芳香三维网状聚合物[4-5]制约秸秆利用，随着近年来畜牧业扩增，使之农业污染问题逐步凸显出来[6]，已成为制约我国生态环境建设和经济发展的突出问题[7]，在解决秸秆和畜禽粪便对环境造成污染问题上，目前主要采用厌氧发酵技术[8-10]，因为厌氧发酵技术不仅可以将玉米秸秆和畜禽粪便进行发酵制备生物燃气，而且还可以降低农民日常的生活成本，提高农业废弃物资源利用率缓解污染，利于乡村生态文明发展[11]。

目前，绝大多数实验都是运用Box-Behnken设计添加物单独和玉米秸秆或牛粪的厌氧发酵实验，还有部分实验只是单独对玉米秸秆厌氧发酵进行研究或单独对牛粪厌氧发酵研究。在运用Box-Behnken优化生物炭与牛粪混合厌氧发酵工艺实验中，王粟，史风梅，李家磊等[12]通过比较不同生物炭原料对牛粪厌氧发酵产气效率的影响，发现水稻秸秆炭、玉米秸秆炭、稻壳秸秆炭三者之中，添加水稻秸秆生物炭原料对厌氧发酵产气量的提升最为明显。张浩等[13]在研究钢渣微粉对牛粪厌氧发酵产沼气的影响中发现向牛粪厌氧发酵料液中添加钢渣微粉不仅可以获得较好的产气效果，还可以加快发酵，缩短发酵周期，提高了发酵效率，降低了发酵成本在实际运用中有良好的实用性。Zi-Lin S等[14]通过改良过氧化氢的消化工艺优化了秸秆的木质素、纤维素和半纤维素降解，提高沼气产气率。在单独对玉米秸秆厌氧发酵实验中，李莹等[15]通过控制预处理发酵秸秆温度对玉米秸秆的影响，经过多次试验后发现通过控制温度、pH、玉米秸秆预处理时间，H2SO4浓度对玉米秸秆预处理可以提高玉米秸秆的产气量。Liu Shan等[16]在研究尿素对巨型芦苇青贮和序贯厌氧消化的影响中，发现尿素的添加降低了青贮过程中芦苇纤维素和半纤维素的降解，提高了木质素的降解，提高甲烷产量。在对牛粪厌氧发酵研究实验中，张振等[17]研究了灰分对牛粪厌氧干发酵产气效率的影响，发现添加灰分对牛粪厌氧干发酵有促进作用。李云芳等[18]研究了进料配比对牛粪和玉米秸秆半连续厌氧发酵的影响当牛粪和玉米秸秆的TSMR（Total Solid Mixing Ratios，TSMR）为1∶3时，发酵系统的产气性能明显提高，分别比纯牛粪和纯玉米秸秆发酵提高了23.67%和20.44%。Wang H，Xu J[19]进行了牛粪、鹿粪、蘑菇菌的混合试验，系统的研究了不同温度（20、35、50℃）下AD沼气产量（日产量和累积产气量）、CH4含量、挥发性脂肪酸（VFAs），结果表明，随着温度的升高，沼气池的产气率和累积产气率各比例均增加。经过以上多种实验分析，发现温度、添加物、固体质量浓度对发酵产气影响尤为突出，为运用响应面建立黄贮和牛粪混合厌氧发酵实验提供了单因素参考范围。

实验主要采用Box-Behnken设计，以黄贮和牛粪混合固体质量浓度（TS）、发酵温度、添加的不同浓度的NaOH，KOH为单因素，探究对混合固体厌氧产气的影响。确定连续厌氧发酵的生物产气最高值的固体质量浓度（TS）、发酵温度、NaOH的添加量，使之建立大庆周边黄贮和牛粪混合发酵数学模型为以后的大庆的生物燃气应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

黑龙江省大庆市周围黄贮和大庆市杏树岗奶牛广场的牛粪，黄贮秸秆采集放入透气的袋子（河北康宁编织品有限公司）中保持干燥。牛粪收集于真空塑料袋（通利达公司）备用牛粪放入保温柜中温度控制在0～5℃。接种物取自实验室，接种物在静置数日后倒去上清液，将沉淀物放入5℃冰箱。

表1 实验原料基本参数Table 1 Basic parameters of experimental materials

表2 混合固体浓度（TS）配置方法Table 2 Mixed solid concentration（TS）configuration method

1.2 实验装置

实验装置如图1、由3个500 mL广口发酵瓶、2个真空袋、电热恒温培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，仪器编号HPX-9272MBE）、以及DW-9型微生物试剂分液器（杭州大微生物技术有限公司，仪器编号K17090214169），将实验原料放入500 mL广口瓶中，并用软胶管与真空袋连接，之后放入电热恒温培养箱中进行厌氧发酵，控制发酵温度，采集的实验真空袋用DW-9型微生物试剂分液器导出，其仪器导出气体端口连接饱和食盐水的发酵瓶，并运用排水法测量[20]发酵所产出气体体积。

图1 混合厌氧发酵装置Fig.1 Mixed anaerobic fermentation device

1.3 实验方法

1.3.1 单因素试验设计

分别用1%NaOH、2%NaOH、3%NaOH、1%KOH、2%KOH、3%KOH对黄贮进行预处理，控制黄贮和牛粪混合的固体量浓质度（TS）10%，和培养温度35℃。以黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气为响应值，观察35 d不同浓度KOH对黄贮处理方法对混合厌氧发酵产气效果的影响。在实验范围内调整单个因素，观察黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气量。以上厌氧发酵实验应该严格处于厌氧环境的条件下。

1.3.2 Box-Behnken实验设计

以单因素实验为基础，选取以上检测指标影响显著的3个因素，设定合理的水平，进行三因素三水平实验设计，以NaOH添加量、b发酵温度、c黄贮和牛粪混合的固体质量浓度（TS）为变量，选取-1，0，1为自变量的水平，黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气为响应值Y，根据Design Expert8.0的多元二次回归方程，得到变量与响应值最佳的配比。

1.4 实验测定

牛粪（TS）、黄贮（TS）、黄贮和牛粪混合的固体质量浓度（TS）、接种物的（TS）的测定是将实验样品放入干燥箱烘干内，烘干到恒重，恒重样品质量与原先的样品质量的比用百分率表示。牛粪（VS）、黄贮（VS）、黄贮和牛粪混合的固体质量浓度（VS）、接种物的（VS）的测定用恒温干燥箱，马弗炉，瓷干锅，干燥器测出样品中挥发性有机物的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素对黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气的影响

在实验中分别添加1%NaOH、2%NaOH、3%NaOH、1%KOH、2%KOH、3%KOH，控制混合黄贮和牛粪混合的固体质量浓度（TS）10%，培养温度为35℃，以黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气为评价指标，系统的比较黄贮秸秆和牛粪厌氧发酵实验中添加剂对混合厌氧发酵产气的影响。由图2可知，黄贮与牛粪混合厌氧发酵产气量的整体趋势是显著升高，在黄贮与牛粪混合厌氧实验中添加2%NaOH的总产气量高于实验的其它样品的产气量。添加1%KOH、2%KOH、3%KOH虽然使黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气发生变化，但由图2可知其1%KOH、2%KOH、3%KOH的黄贮与牛粪混合厌氧发酵总产气量相比于1%NaOH、2%NaOH、3%NaOH对黄贮与牛粪混合厌氧发酵总产气量效果不显著，添加2%NaOH总厌氧发酵产气量为1 752 mL高于1%NaOH、与3%NaOH总厌氧发酵产气量1 421、1 573 mL。所以可以确定添加2%NaOH对黄贮和牛粪混合厌氧发酵实验产气作用最显著。

图2 KOH、NaOH对总产气量的影响Fig.2 Effects of KOH and NaOH on total gas production

在实验范围内，黄贮和牛粪厌氧发酵中添加的NaOH、发酵温度、黄贮和牛粪混合的固体质量浓（TS）对其中温度进行调整，以黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气总量为评价标准。

在黄贮秸秆与牛粪混合厌氧发酵中添加2%NaOH，黄贮和牛粪混合的固体质量浓度（TS）为10%的条件下，发酵温度分别为30、35、40、45、50℃，观察发酵温度对混合厌氧发酵产气影响。根据图3可知实验过程中每7天对黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气总量进行测量一次，整体厌氧发酵产气总量为上升趋势，21～28 d的整体产气速率高于其他间隔天数，在40℃条件下总产气量1 824 mL高于其他温度的总产气量。

图3 发酵温度对总产气量的影响Fig.3 Effects of fermentation temperature on total gas production

在黄贮与牛粪混合厌氧发酵产气实验中控制实验厌氧发酵温度为40℃，实验NaOH浓度为2%的条件下，改变黄贮和牛粪混合的固体质量浓度（TS）。在黄贮秸秆与牛粪混合厌氧发酵中分别添加10%、12%、14%黄贮和牛粪混合固体质量，观察35 d中10%、12%、14%的黄贮和牛粪混合固体质量对整体实验厌氧发酵产气效果的影响。由图4可知黄贮和牛粪混合固体质量浓度（TS）10%、12%、14%的总产气量随着时间的增加呈现上升状态，黄贮与牛粪混合固体质量浓度为12%时总气量最高为1 970 mL，大于黄贮与牛粪混合固体质量浓度10%、14%的总产气量1 824、1 774 mL。

图4 混合固体对总产气量的影响Fig.4 Effects of mixed solids on total gas production

2.2 Box-Behnken结果分析

表3 Box-Behnken设计试验因素与水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design experiments

由表4得到二次多项回归方程为黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气总量=2 152.40+27.65 A-85.25 B+25.88 C+4.25 AB+14.50 AC-50.75 BC-191.2 A2-275.95 B2-153.70 C2通过该方程得到的表5进行分析可知该回归模型的F=25.37、P=0.000 2、因为P＜0.01则说明该模型差异性明显，又由该二次方程失拟项中F值可知F=5.79、P=0.061 4、P＞0.05说明该模型失拟中差异性不明显，与真实的实验融合度高，整体误差小，可以进行该实验最优化分析。模型的决定系数R2=0.970 2、调整决定系数R2adj=0.932 0说明在实验中93.20%是由该实验因素引起的。模型的C.V.%=3.01、Adeq Precision=13.594 8则证明该实验模型准确性高，可信度高。

表4 各因素组合及结果Table 4 Combination and results of each factor

表5 回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model

由该方程可知，温度F值1.94、P=0.205 9、NaOH浓度F值1.71、P=0.232 8当P＜0.05为差异显著所以可知温度NaOH浓度对混合厌氧发酵产气量影响有限，黄贮和牛粪混合浓度（TS）F值18.52、P=0.003 6当P＜0.01为差异极显著所以可知黄贮和牛粪混合浓度（TS）对厌氧发酵产气量实验影响极显著。又由该方程的p值可知A2、C2、B2、对实验影响极显著。

2.3 因素交叉分析

利用Design Expert8.0软件对该二次多项回归方程进行响应面分析，得到实验各个因素交叉相互作用的等高线图，所得到等高线图呈现椭圆状则说明两者交叉作用对黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气效果显著。

根据图5和图6对NaOH浓度与温度两者因素交叉分析可知，黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气量随着温度和NaOH浓度增加呈现升高趋势，当黄贮和牛粪混合厌氧发酵的产气量达到最高点后呈现缓慢下降状态，同时，在NaOH浓度与温度两因素中，NaOH浓度相对于温度来说对实验混合厌氧发酵产气量的影响更加显著。

图5 、6 NaOH浓度和温度对总产气量的影响Fig.5 and 6 Effects of NaOH concentration and temperature on total gas production

由图7、8得到黄贮与牛粪混合固体质量浓度和NaOH浓度两因素交叉所得到等高线图呈现椭圆状说明两因素对黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气效果明显。由于其平面图可知在NaOH浓度和黄贮与牛粪混合固体质量浓度两因素中，牛粪混合固体质量浓度对实验混合厌氧发酵产气量的影响相对NaOH浓度对实验混合厌氧发酵产气量更加显著。

图7 、8 NaOH浓度和混合浓度对总产气量的影响Fig.7 and 8 Effects of NaOH concentration and mixture concentration on total gas production

由图9、10可知在黄贮与牛粪混合固体质量浓度和温度两因素之中，黄贮与牛粪混合固体质量浓度对实验混合厌氧发酵产气量的影响相对于温度对实验混合厌氧发酵产气量的影响弱一些。黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气量随着黄贮与牛粪混合固体质量浓度与NaOH浓度增加呈现急速升高的趋势，当混合产气量达到最高峰后又随着黄贮与牛粪混合固体质量浓度与NaOH浓度的增加呈现缓慢下降。

图9 、10 温度和混合浓度对总产气量的影响Fig.9 and 10 Effects of temperature and mixing concentration on total gas production

3 讨论

经过以上实验，发现1%NaOH、2%NaOH、3%NaOH对黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气量相比较于1%KOH、2%KOH、3%KOH对黄贮与牛粪混合厌氧发酵总产气量更加显著，根据金属活泼性判断，即越活泼的金属对应的氢氧化物的碱性越强，所以可知KOH比NaOH的碱性强，又因为化学物质的碱性强弱与其碱的电离程度有关，而KOH与NaOH都是完全的强电解质，所以根据摩尔质量即单位物质的量的物质所具有的质量，KOH和NaOH的相对分子质量分别是56、40，则KOH和NaOH固体的摩尔质量分别是56、40 g·mol-1、物质的量=物质的质量÷物质的摩尔质量，则相同质量的KOH和NaOH固体的物质的量之比为m56 g·mol-1∶m40 g·mol-1=5∶7，所以在实验中添加1%KOH、2%KOH、3%KOH、1%NaOH、2%NaOH、3%NaOH的混合厌氧发酵产气实验中，在控制混合黄贮和牛粪的固体质量浓度10%，培养温度为35℃不变情况下，OH-的比例分别为5∶10∶15、7∶14∶21又因其实验总产气量分别为1 241、1 264、1 297、1 421、1 752、1 573 mL可以发现溶液中OH-根比为15、14时其总产气量分别是1%NaOH、2%NaOH、3%NaOH和1%KOH、2%KOH、3%KOH中产气的最高值，则可以确定溶液中OH-根比例为15左右对实验混合厌氧发酵产气量的影响更加显著，而NaOH溶液整体比KOH溶液整体产气量高，可能是因K+对实验牛粪混秸混合中的牛粪菌群有一定厌氧抑制作用，其猜测还需要进一步实验进行验证。

4 结论

采用单因素试验，比较添加不同浓度KOH、NaOH对混合厌氧发酵产气效率的影响。结果发现1%NaOH、2%NaOH、3%NaOH对黄贮和牛粪混合厌氧发酵产气量相比较于1%KOH、2%KOH、3%KOH对黄贮与牛粪混合厌氧发酵总产气量更加显著，所以采用NaOH添加量、发酵温度、黄贮和牛粪混合的固体质量浓度为变量，采用响应面法对该模型交叉分析，最后得到该模型最优的工艺条件为NaOH浓度为2.115%，温度为40.374℃，黄贮与牛粪混合固体质量浓度（TS）11.67%，预测最佳的混合产气量2161.92 mL。为了验证最佳优化工艺的准确性，首先对黄贮与牛粪混合固体质量浓度（TS）进行配置。用黄贮14.10 g，牛粪36.50 g配置黄贮与牛粪混合固体质量浓度（TS）11.70%，控制NaOH浓度为2.11%，温度为40.40℃进行了5次实验，取其平均值获得实验数据2 150±40 mL在该模型预测范围2%以内，更加验证该模型准确性，证明该黄贮与牛粪混合发酵的数学模型可以为生物燃气应用提供参考。