董宪慧，李梦竹，穆秋霞，类彦波，崔素萍

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心；3.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心；4.大庆市食品药品检验检测中心）

不良的饮食习惯、环境污染以及药物滥用，会导致体内产生过量的自由基，引发体内氧化应激反应[1]，人体需要额外补充抗氧化剂来维持体内氧化/抗氧化平衡。抗氧化剂分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂[2]。合成抗氧化剂由于存在健康风险而受到严格限制[3]。天然抗氧化剂来源广泛，具有安全、无毒、高效的特点[4]，已成为抗氧化剂领域的研究热点。抗氧化肽作为天然抗氧化剂，抗氧化性高，易于人体消化吸收[5]，还具有治疗癌症、疟疾、高血压等疾病的潜力[6-7]。因此，抗氧化肽在食品添加剂、化妆品和保健品等领域中具有广阔的应用前景。

抗氧化肽主要有动物来源和植物来源的[8]，植物蛋白抗氧化肽具有延长食品保质期[9-11]、增强记忆[12-13]及醒酒[14]等作用。由于抗氧化肽的粉剂不便于携带和食用，片剂可以弥补这一不足。陈安国[15]利用火麻活性肽制备的抗氧化产品口感饱满，抗氧化活性高，具有降血压、抗疲劳的功效；刘国飞[16]利用豌豆肽、玉米肽、黑豆肽制备的复合肽固体饮料和咀嚼片，抗氧化效果好、成本低、易于工业化生产；邵伟[17]利用大豆肽制作的咀嚼片便于保存携带、能缓解身体疲劳。咀嚼片具有易于保存运输，携带、食用方便等特点[18]，且嚼碎吞服后产品表面积增加，不需在胃中解崩，易于有效物质消化吸收[19]，兼具粉剂和片剂的优点，非常适宜承载抗氧化肽产品。

团队前期研究表明，英国红芸豆各抗氧化肽组分的DPPH自由基清除率均大于70%，抗氧化性最强的组分具与维生素C的抗氧化性相近[20]，国外暂无对于芸豆蛋白抗氧化肽产品的开发和应用，国内仅有张景田[21]利用包括白芸豆肽在内的多种小分子肽制备具有益肌骨损伤愈合功效的固体饮料，研究较少，并未充分发挥芸豆蛋白抗氧化肽的利用价值。拟以英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分为主料，研究咀嚼片的最佳配方及压片条件，为英国红芸豆抗氧化肽产品的开发提供途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

英国红芸豆：购于大庆市新玛特超市；辅料（山楂粉：河北美威药业股份有限公司；甘露醇、麦芽糊精、微晶纤维素、硬脂酸镁：河南千志商贸有限公司）过80目筛子备用。

碱性蛋白酶：活性≥200000活力单位/克，北京鑫泽天佑生物科技有限公司；DPPH：北京博奥拓达科技有限公司；维生素C：天津金玻化实验设备有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、胆酸钠：北京索莱宝科技有限公司；煌绿乳糖胆盐肉汤、平板计数琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

FW-4A型粉末压片机：天津市拓普仪器有限公司；CHRIST Alpha型冷冻干燥机：德国Marin Christ公司；U-2910紫外可见分光光度计：上海斯迈欧分析仪器有限公司；ZBS-6E智能崩解试验仪：天津市天大天发科技有限公司；WB-98A型片剂脆碎度：北京国立和分析仪器技术开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分的制备

英国红芸豆蛋白质的提取及抗氧化肽组分的制备方法见参考文献[22]，抗氧化肽组分真空冷冻干燥后低温储存备用。

1.3.2 抗氧化肽组分咀嚼片的研制

（1）单因素试验

在硬脂酸镁添加量1%、微晶纤维素添加量适当调整的条件下，分别考察主料（40%、50%、60%、70%、80%）、麦芽糊精（3%、4%、5%、6%、7%）、甘露醇（10%、15%、20%、25%、30%）、山楂粉（1%、2%、3%、4%、5%）等添加量对咀嚼片感官品质的影响，每个处理做3次重复。

（2）正交试验

在单因素试验的基础上，对咀嚼片配方进行正交优化，采取L9（33）正交设计，进一步确定咀嚼片的配方。

（3）验证试验

按照正交试验得出的最优组合制作咀嚼片并进行验证。

1.3.3 咀嚼片评价

（1）感官品质评价

选择10位身体健康的食品科学与工程专业在读研究生，对咀嚼片进行感官评定，评分标准[23]见表1。

表1 英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分咀嚼片感官评分标准Table 1 Sensory scoring criteria for British red kidney bean protein antioxidant peptide component chewable tablets

（2）片重差异、脆碎度的分析

由大庆市食品药品检验检测中心按照《中国药典》（2015版）[24]方法测定咀嚼片的重量差异和脆碎度。

（3）微生物指标分析

依据GB/T 4879.2-2016《食品微生物学检验-菌落总数测定》和GB/T 4879.3-2016《食品微生物学检验—大肠菌群计数》分别对咀嚼片进行微生物指标分析。

（4）人体每日服用剂量的确定

将维生素C和英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分按质量浓度分别为1、2、4、5、10、20、40、50 mg·mL-1进行羟基自由基清除率的测定，通过维生素C每日的摄入量确定咀嚼片的摄入量。

1.3.4 抗氧化性分析

参照参考文献[25]的方法对英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分、咀嚼片及咀嚼片中肽组分的DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和还原力进行测定。

1.3.5 统计分析方法

利用IBM SPSSStatistics 23软件对数据进行显著性分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 抗氧化肽组分咀嚼片的制备

2.1.1 抗氧化肽组分添加量对咀嚼片感官质量的影响

固定混合料中其它辅料的添加比例，抗氧化肽组分添加量对咀嚼片感官品质的影响见表2。

表2 抗氧化肽组分及麦芽糊精添加量对咀嚼片感官品质的影响Table 2 Effects of antioxidant peptide content and maltodextrin content on sensory quality of chewable tablets

当添加量为60%时，感官评分最高，且差异显著（P＜0.05）。因此，在咀嚼片的配方中，确定肽组分的添加量为60%。抗氧化肽组分颜色为浅棕色，味苦涩并有特殊的味道。随着抗氧化肽组分添加量的增加，咀嚼片颜色逐渐变深，苦味和肽特有的味道逐渐增加。由于肽具有吸湿性，吸湿后的肽会表现出流动性差、黏性强等不良特点，影响片剂的可压性[26]。当肽含量逐渐增大时，肽吸收的水分受挤压到颗粒表面将可溶物质溶解，待压力撤除后溶解物析出，相邻颗粒间产生“固体桥”，使颗粒间牢固结合，咀嚼片表面因而固结成块[27]，导致表面粗糙度增加，硬度逐渐增大。

2.1.2 麦芽糊精添加量对咀嚼片感官质量的影响

麦芽糊精口感滑腻、具有特殊的糊味，易被人体消化吸收。因其具有溶解性、稳定性和填充效果较佳、吸湿性低、粘结性较强等特点，常被用作粉末压片中的填充剂和粘合剂[28]。当主料添加量为60%，山楂粉、甘露醇、硬脂酸镁添加量分别为3%、21%、1%，麦芽糊精添加量为3%～7%时，麦芽糊精添加量对咀嚼片感官质量的影响见表2。随着麦芽糊精添加量的增加，咀嚼片的外观色泽无明显变化，表面逐渐细腻，硬度逐渐增大。这是由于麦芽糊精的添加降低了粉剂的吸湿性，使咀嚼片表面固结的程度降低而变得细腻；由于麦芽糊精的黏性使粉剂颗粒间结合更紧密，导致硬度增大。麦芽糊精量增加，咀嚼片苦味有所减弱，但随着麦芽糊精量继续增加，其本身的糊味逐渐显现，与苦味相叠加造成口感更苦。因此，麦芽糊精添加量为5%时，颜色乳白、硬度适中、口感最佳，且差异显著（P＜0.05）。

2.1.3 山楂粉添加量对咀嚼片感官品质的影响

山楂粉添加量对咀嚼片感官品质的影响见3。

山楂粉的颜色偏红，口味酸甜、具有山楂特有的浓香，其中含有的大量膳食纤维，能提高产品的咀嚼性，又因其具有吸湿性，使其黏性增加[29]。当主料添加量为60%，麦芽糊精、甘露醇、硬脂酸镁添加量分别为5%、21%、1%，山楂粉添加量为1%～5%时，随着山楂粉添加量的增加，颜色略微加深，苦味得到改善，由于黏性和吸湿性增加导致硬度变大，当山楂粉添加量为3%时，颜色乳白、硬度适中、口感最佳，且差异显著（P<0.05）。

2.1.4 甘露醇添加量对咀嚼片感官品质的影响

甘露醇入口即溶，有清凉感，且无吸湿性，常作为填充剂[30]和矫味剂。甘露醇添加量对咀嚼片感官品质的影响结果如表3。当主料添加量为60%，麦芽糊精、山楂粉、硬脂酸镁添加量分别为5%、3%、1%，甘露醇添加量为10%～30%时，随着甘露醇添加量的增加，咀嚼片的外观无明显变化，苦味逐渐减小，表面逐渐细腻，硬度逐渐减小，当甘露醇添加量为30%时，硬度适中，且差异显著（P＜0.05）。

表3 山楂粉及甘露醇添加量对咀嚼片感官品质的影响Table 3 Effects of hawthorn powder and mannitol content on sensory quality of chewable tablets

2.1.5 正交试验优化咀嚼片的配方

在单因素试验的基础上进行L9（33）正交试验（表4），在抗氧化肽组分添加量为60%条件下，选取麦芽糊精（因素A）、山楂粉（因素B）、甘露醇（因素C）3因素做正交试验，试验结果见表5、6和7。

表4 咀嚼片配方L 9（33）因素水平表Table 4 L9（33）factors and levels of chewable tablets formulation

表5 咀嚼片配方正交试验结果Table 5 Orthogonal experimental results of chewable tablet formulations

续表5 咀嚼片配方正交试验结果Continued table 5 Orthogonal experimental results of chewable tablet formulations

表6 咀嚼片配方的正交试验Table 6 Influences of orthogonal test on the formula of chewable tablets

表7 咀嚼片配方方差分析表Table 7 Analysis of variance of chewable tablet formula

由正交试验结果及方差分析可知，因素A（麦芽糊精）、B（山楂粉）和C（甘露醇）的影响均未达到显著水平。因此，正交试验中的得到的较优压片方案A1B1C3为最优方案，配方中的添加量分别为：抗氧化肽组分60%，麦芽糊精4%、山楂粉2%、甘露醇30%、硬脂酸镁1%、微晶纤维素3%时，压片的效果较好，形成的咀嚼片颗粒光滑、圆整，口感最佳。

2.1.6验证试验

采用粉末直接压片方法在26 MPa下，对最优配方A1B1C3进行验证性压片，产品的感官评分为87.5±1.02，高于正交试验中各组的感官评分，且颜色乳白、口感适中、硬度适中。

2.2 性能分析

2.2.1 重量差异

英国红芸豆蛋白抗氧化肽组分咀嚼片的片重差异见表8。

表8 片重差异检查结果Table 8 Weight variation test results

根据《中国药典》（2015版），平均片重在0.30 g及以上的片剂，片重差异限度为±5%。表10中的最大片重差异为-1.8%，符合药典规定。

2.2.2 脆碎度

2015年版《中国药典》四部通则第0923号崩解时限测定法规定平均减失重量不得超过1%。咀嚼片平均减失重量在7%左右，不符合中国药典的规定。甘露醇添加量增大会导致咀嚼片硬度减小、脆碎度变大[31]，当甘露醇添加量为25%时，咀嚼片的脆碎度达到1.51%，不符合标准。来思彤[32]研究发现，随着制片压力增大，咀嚼片硬度增大、脆碎度降低。因此，在甘露醇添加量增大咀嚼片的口感变佳的情况下，需进一步探索制片压力对咀嚼片性能的影响。

2.2.3 微生物限度测定

《中国药典》（2015版）中非无菌药品微生物限度检查指标见表9，其中n为样本数量、c为最大可允许超过m值的样本数、m为微生物指标可接受水平的限量值、M为微生物指标的最高安全限量值。咀嚼片菌落总数为1 000 CFU·mL-1，大肠杆菌为5 CFU·mL-1，符合国家标准。

表9 微生物限量指标Table 9 Microbial limit index

2.2.4 人体每日服用剂量的确定

维生素C与抗氧化肽组分羟基自由基的清除率变化见图2。

当维生素C质量分数为2 mg·mL-1时，清除率达到99%以上，而抗氧化肽组分质量分数约为31.4 mg·mL-1时，具有与维生素C相同的清除率，因此人体摄入抗氧化肽组分的量应为维生素C的15.7倍。人体每日需额外摄入维生素C约100 mg[33]，因此推算，人体须摄入抗氧化肽组分1 570 mg，按每片咀嚼片含抗氧化肽组分180 mg计算，每天需服用约9片，建议每天3次每次服用3片。

2.2.5 抗氧化肽组分咀嚼片抗氧化性能分析

在抗氧化肽组分含量为2 mg·mL-1时，咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽组分、单纯抗氧化肽组分（对照）的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率及还原力结果见表10。

由表10可知，咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽组分的DPPH自由基清除率与对照相比略有下降但不显著（P＞0.05）；咀嚼片、咀嚼片中的抗氧化肽组分的羟基自由基清除率和还原力与对照相比显著增加（P＜0.05），但DPPH自由基清除率变化并不显著。研究表明，不同种类抗氧化肽的抗氧化性表现方式不尽相同，酪蛋白水解产物的抗氧化性表现为自由基的清除能力[34]、酪蛋白磷酸肽的抗氧化性主要表现为金属离子螯合能力[35]。肽抗氧化性的强弱不但与相对分子质量以及氨基酸组成有关[36]，而且与其结构特征尤其是肽键形式有关[37]，在压片的过程中巨大的压力可能会对抗氧化肽结构产生影响。此外，咀嚼片辅料中的其他成分也会与抗氧化肽相互作用影响抗氧化性[38]。因此，将肽组分制成咀嚼片后抗氧化性的变化原因较为复杂，具体原因有待后续研究。

图1 相同浓度维生素C与抗氧化肽组分羟基自由基的清除率变化Fig.1 Changes in the scavenging rate of the same concentration of vitamin Cand antioxidant peptide hydroxyl free radicals

表10 咀嚼片的抗氧化性分析Table 10 Antioxidant analysis of chewable tablets

3 结论

采用粉末直接压片方法在26 MPa下，英国红芸豆抗氧化肽组分咀嚼片的最佳配方中各种材料的添加量分别为：抗氧化肽组分60%、麦芽糊精4%、山楂粉2%、甘露醇30%、硬脂酸镁1%、微晶纤维素3%。使用该配方制作的咀嚼片性状稳定、口感良好、易于吸收，具有一定的抗氧化能力，为有效的抗氧化产品。研究说明将英国红芸豆抗氧化肽制成咀嚼片为其提供有效的产品开发途径，可以更好发挥其价值。