任 洁，郝巧歆，黄成河，陈 勋，卢 欣

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种肝脏脂肪过度堆积为特征的临床常见疾病[1]。2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)是一种常见的代谢性疾病，患者多存在胰岛素抵抗(IR)现象[2]。相关研究表明[3，4]，NAFLD和T2DM患者均存在肠道菌群结构改变现象。肠道菌群的组成和分布与体质、饮食习惯、免疫功能等多种因素有关。近年来，随着对微生物领域的深入研究，发现肠道微生态在机体炎症反应和免疫调节等方面发挥着重要的作用[5]。NAFLD合并T2DM患者肠道菌群结构与IR和血清炎性因子关系尚不明确。本研究检测了我院收治的NAFLD合并T2DM患者肠道菌群结构及其血清炎性因子水平的变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2018年6月～2020年7月我院收治的NAFLD合并T2DM患者58例，男36例，女22例，年龄为23～62岁，平均年龄为(50.1±6.7)岁；NAFLD患者66例，男42例，女24例，年龄为23～61岁，平均年龄为(51.4±6.7)岁。NAFLD诊断依据《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[6]的标准，T2DM的诊断符合《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[7]的标准。排除标准：合并恶性肿瘤、酒精性肝病或病毒性肝炎、胆道疾病、合并急慢性胃肠道疾病、免疫缺陷病、妊娠期或哺乳期女性。另选择同期在我院体检的健康者60例，男38例，女22例，年龄为26～63岁，平均年龄为(49.3±6.4)岁。受试者签署知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会审核通过。

1.2 肠道菌群检测 收集所有研究对象晨起新鲜粪便，置于-80℃冰箱冻存待测。采用二代基因测序技术，提取粪便总基因组DNA(北京百奥莱博科技有限公司)。针对16 srRNA基因V3～V4高变序列进行扩增测序，其中上游引物为5’-TTTGAAGTTCCCATGTACTGTG-3’，下游引物为5’-CTGCATTGCATTGCTTTACGTA-3’，产物长度为106 bp。筛选出高质量的有效序列，并划分为可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，通过与肠道菌群GENBA-NK数据库进行序列比对，对肠道菌群的种类和结构进行鉴别分析。

1.3 血清检测 使用上海聚慕医疗器械有限公司生产的HGM-126T型欧姆龙医用血糖仪检测空腹血糖(fasting blood glucose，FPG)；采用化学发光法测定血清空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)，并计算稳态模型胰岛素抵抗(homeostasis model assessment - insulin resistance steady state model insulin resistance，HOMA-IR)指数，即HOMA-IR=FINS×FPG/22.5。当HOMA-IR>2.69时，表示患者存在胰岛素抵抗[8]；采用ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α，试剂盒购于上海将来实业股份有限公司)；采用免疫层析法测定血清超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP，试剂盒购于广州万孚生物技术有限公司)。

2 结果

2.1 三组血清指标比较 NAFLD合并T2DM组血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglycerides，TG)和FPG水平均显著高于NAFLD组或健康人(P<0.05)，NAFLD组血清AST、ALT 、TC和TG水平显著高于健康人(P<0.05，表1)。

表1 三组人群血清指标比较

2.2 三组粪肠道菌群结构比较 三组人群粪梭杆菌门、变形菌门、巨单胞菌属、双歧杆菌属和普雷沃菌属丰度比较差异均无统计学意义(P>0.05)；三组人群粪拟杆菌门、厚壁菌门、柔嫩梭菌属、厌氧棍状菌属和布劳特菌属丰度比较差异均有统计学意义(P<0.05)。NAFLD合并T2DM组粪拟杆菌门显著高于NAFLD组或健康人(P<0.05)，NAFLD组粪拟杆菌门显著高于健康人(P<0.05)；NAFLD合并T2DM组粪厚壁菌门、柔嫩梭菌属、厌氧棍状菌属和布劳特菌属丰度均显著低于NAFLD组或健康人(P<0.05)，NAFLD组粪厚壁菌门、柔嫩梭菌属、厌氧棍状菌属和布劳特菌属丰度均显著低于健康人(P<0.05，表2、表3)。

2.3 三组人群胰岛素抵抗指数和血清炎性因子水平比较 NAFLD合并T2DM组和NAFLD组HOMA-IR指数、血清TNF-α和hs-CRP水平均显著高于健康人(P<0.05，表4)。

表2 三组粪肠道菌群结构(%)比较

表3 三组粪肠道菌群结构(%)比较

表4 三组胰岛素抵抗指数和血清炎性因子水平比较

3 讨论

NAFLD合并T2DM的发生与遗传、饮食和生活方式的改变等多种因素有关。人体肠道是一个多元化的微生态系统，肠道菌群约为500多种，与机体共生并处于动态平衡状态，参与食物的消化、维生素的吸收和蛋白质的合成等，可影响机体内环境，是肠道的天然屏障[8，9]。相关研究表明[10，11]，NAFLD和T2DM与肠道菌群结构改变和炎症反应等有关。探讨NAFLD合并T2DM患者肠道菌群结构及其与胰岛素抵抗和血清炎性因子变化的关系具有十分重要的临床意义。

本研究结果表明，NAFLD合并T2DM患者粪拟杆菌门显著高于NAFLD组或健康人(P<0.05)，NAFLD组粪拟杆菌门又显著高于健康人；NAFLD合并T2DM组粪厚壁菌门、柔嫩梭菌属、厌氧棍状菌属和布劳特菌属丰度均显著低于NAFLD组或健康人，NAFLD组粪厚壁菌门、柔嫩梭菌属、厌氧棍状菌属和布劳特菌属丰度均又显著低于健康人，提示NAFLD合并T2DM患者肠道菌群结构存在明显异常。在正常情况下，肠道微生态处于动态平衡，一旦该平衡被打破，条件致病菌数量就会明显增多，可引发肠道炎症，直接破坏肠道黏膜屏障，激活免疫系统的功能，致使肠道发生炎性病变[12，13]。人体肠道微生物种类繁多，在正常情况下，机体肠道菌群与宿主之间处于一种动态平衡状态。一旦菌群结构平衡被打破，失调的菌群将通过免疫、生化、神经内分泌等多种途径影响机体的免疫和代谢功能[14，15]。本研究结果显示，NAFLD合并T2DM组和NAFLD组HOMA-IR指数、血清TNF-α和hs-CRP水平均显著高于健康人，NAFLD合并T2DM组HOMA-IR指数和血清hs-CRP水平均又显著高于NAFLD组，提示相对于NAFLD患者或健康人，NAFLD合并T2DM患者HOMA-IR指数及血清TNF-α和hs-CRP水平异常增高，本研究与有关研究[16]结果相近。T2DM患者发生胰岛素抵抗的主要机制为长期慢性炎症状态导致的对胰岛素不敏感，该炎症损伤可降低机体的免疫功能，免疫细胞释放炎性因子致使产生胰岛素抵抗。血清TNF-α和hs-CRP是临床常用的炎性因子指标，能够反映机体的炎症反应状态[17，18]。肠道微生态与机体即相互协调又相互制约，肠道菌群失调，致使微生物拮抗作用降低，致病菌和条件性致病菌侵袭，极易诱发机体免疫性功能紊乱。这种紊乱又可致使机体微生态发生改变[19，20]。本研究发现，NAFLD合并T2DM组粪拟杆菌门显著高于NAFLD组或健康人(P<0.05)，NAFLD组粪拟杆菌门又显著高于健康人(P<0.05)；NAFLD合并T2DM组粪厚壁菌门、柔嫩梭菌属、厌氧棍状菌属和布劳特菌属丰度均显著低于NAFLD组或健康人(P<0.05)，NAFLD组厚壁菌门、柔嫩梭菌属、厌氧棍状菌属和布劳特菌属丰度又均显著低于健康人(P<0.05)。这些发现对进一步研究其临床意义提供了临床依据。

NAFLD，又被称为代谢相关性脂肪性肝病(MAFLD)。NAFLD不仅与T2DM有关，还与高脂血症、胆石症、高血压和心脑血管疾病有关。研究纳入人群的年龄、合并疾病及其治疗情况不同，都可能影响观察结果。研究粪菌结构的变化只从分子生物学的角度检测可能也存在一些问题，这些都需要认真的分层控制和方法学的改进才能解决。

综上所述，NAFLD合并T2DM患者肠道菌群结构发生了显著的改变，机体存在显著的胰岛素抵抗，血清炎性因子水平明显增加。本研究的不足之处在于机体肠道菌群数量庞大、种类繁多。本研究样本量相对较小，检测的细菌种类有限，还需扩大NAFLD合并T2DM患者人群，以进一步探讨肠道菌群改变在疾病发病机制中的作用。