宋苏,苏萍,邹敏,陈烊姣

维生素D的生理功能主要是调节钙磷、骨骼发育、促进机体生长等。近年来，在生殖系统中，例如卵巢、子宫内膜、输卵管以及男性睾丸中均发现有维生素D受体存在，提示维生素D可能参与调节人类生殖[1-2]。越来越多的研究显示维生素D缺乏是不孕女性进行体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(in-vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transplantation,IVF/ICSI-ET)助孕治疗的不利因素。对维生素D缺乏的女性进行维生素D的补充可能有益于其助孕结局。但目前有关维生素D缺乏的不孕女性是否有必要补充维生素D的研究较少。本研究主要目的在于探讨对维生素D缺乏的不孕女性补充维生素D后行IVF/ICSI-ET助孕治疗是否获益，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象与分组

1.1.1 研究对象 选择2019年1月至2020年12月在华中科技大学同济医学院生殖医学中心接受IVF/ICSI-ET助孕治疗的325例不孕症女性患者。纳入标准：年龄均小于35岁；所有对象均排除内科疾病；无子宫畸形和宫颈疾病；无肝肾功能异常；均为第一周期在本中心接受辅助生殖技术助孕治疗；治疗前各项化验指标均正常。排除标准：体质量指数(body mass index，BMI)<18 kg/m2或>28 kg/m2；基础卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone，FSH)>10 mIU/mL；子宫内膜异位症者，有反复妊娠丢失史(定义为3次或以上自然流产)；自身免疫疾病、内分泌紊乱疾病、感染性疾病、抗磷脂抗体综合征、血栓形成状态需要抗凝治疗者；先天性或获得性子宫解剖学异常及子宫肌瘤者；输卵管积水；既往有严重的心血管疾病、肺部及肝肾疾病等；在筛查前3个月内参加过其他试验药物研究；研究者判断有不适合入组的异常情况。记录研究对象的基本资料，包括年龄、不孕年限、不孕原因、BMI、基础FSH，促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)，雌二醇(estrsdiol，E2)、抗苗勒氏管激素(anti-müllerian hormone，AMH)等。

1.1.2 研究分组 325例不孕女性于初次体检时进行血清维生素D水平的检测，将维生素D缺乏的180例患者随机分为两组：A组(90例)仅服用复合维生素(含维生素D 400 IU/片)，每日1粒 ；B组(90例)除每日服用复合维生素外，每日补充维生素D滴剂1 600 IU，共8周至取卵前，补充剂量采用2011年美国内分泌学会推荐的成人补充量[3]。B组有18例患者未按要求进行补充维生素D滴剂，予以剔除。其中，A组进行胚胎移植者50例，为A1组，B组进行胚胎移植者42例，为B1组。追访各组的获卵数、优胚数；追访A1和B1组的获卵数、优胚数、胚胎着床率、临床妊娠率、早期流产率及活产率的情况，研究流程见下页图1。

图1 研究流程图

1.2 材料与方法

1.2.1 血清维生素D检测 采用电化学发光法检测血清25(OH)D水平，罗氏全自动发光仪开机、校准、质控，试剂盒采用美国R&D公司生产的。

血清维生素D水平用 2011年美国内分泌学会临床指南(ENDO 指南)[3]推荐的标准：采用血清25(OH)D评估人体维生素D水平，25(OH)D≥30 ng/mL为维生素D充足，20 ng/mL≤25(OH)D≤29 ng/mL为维生素D不足，25(OH)D<20 ng/mL为维生素D缺乏。

1.2.2 IVF/ICSI-ET促排方案 所有患者均采用早卵泡期长方案，依据本中心临床操作手册，月经周期第1～3天给予肌肉注射达菲林3.75 mg降调节，28～30 d后达到降调标准，即血E210～30 pg/mL，LH 1～3 mIU/mL，双侧窦卵泡在6 mm左右，给予外源性促性腺激素(gonadotropin，Gn)果纳芬进行控制性促排卵。根据卵泡发育情况和血清中E2水平调整Gn剂量。当B超发现一批主导卵泡平均直径在18～20 mm以上，E2值与平均直径大于14 mm卵泡数目相符时(即每个14 mm以上卵泡分泌的E2约为250～300 pg/mL)，根据血LH、E2、P水平决定当晚8:00～9:00给予皮下注射hCG 6 500 IU。36 h后行B超引导下经阴道穿刺取卵。取卵当日开始肌肉注射黄体酮注射液60 mg/d，行黄体支持。取卵后第3天进行胚胎移植，对于不能移植的患者，取消移植，行全胚冷冻保存。所有移植患者均移植两枚第3天卵裂期胚胎。胚胎移植后14 d检测血清hCG值，hCG>10 mIU/mL者继续给予黄体支持；移植30～35 d后B超确定是否临床妊娠。

1.2.3 使用药品 达菲林(3.75 mg/支，醋酸曲普瑞林注射液，法国益普生制药公司)；黄体酮注射液(20 mg/支，浙江仙琚制药)；复合维生素(30片/盒，拜耳医药)；维生素D滴剂(400 IU/粒，青岛双鲸药业)；重组人促卵泡素(果纳芬，450 IU/支，75 IU/支，默克雪兰诺制药)；注射用重组人促黄体激素(乐芮，75 IU/支，默克雪兰诺制药)；注射用重组人绒促性素注射液(艾泽250 ug/6 500 IU/支，默克雪兰诺制药)；地屈孕酮片(达芙通 10 mg/片，20片/盒，雅培制药)。本研究得到华中科技大学同济医学院生殖医学中心医学科学研究伦理委员会批准，伦理批号：【2019】伦审字(05)号。

1.2.4 胚胎质量评价 根据Peter评分系统对卵裂期胚胎进行评分。I级：卵裂球大小均匀，形状规则，透明带完整，胞质均匀，无颗粒现象，碎片<10%；II级：卵裂球大小稍不均匀，形状稍不规则，胞质有颗粒现象，碎片在10%～20%之间；III级：卵裂球不均匀，形状不规则，胞质有明显颗粒现象，碎片在20%～50%之间；IV级：卵裂球严重不均匀，形状严重不规则，胞质有严重颗粒现象，碎片>50%。D3优质胚胎为卵裂球数目≥6个的I、II级胚胎。

1.3 术语定义

临床妊娠：移植后30～35 d，B超检查宫腔内见孕囊(包括单孕囊，双孕囊及宫外妊娠者)确定为临床妊娠；早期流产率：妊娠12周以前发生的流产例数占总妊娠周期数的比例；活产率：分娩活胎的周期数占移植周期的比例。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 325例不孕女性血清维生素D水平分布情况

本研究共对325 例不孕女性进行了血清维生素D水平的检测。其中，血清中维生素D缺乏的有180例，占比55.39%；不足124例，占比38.15%；充足21例，占比6.46%。

2.2 A、B两组基本资料及实验室结局比较

A、B两组间平均年龄、不孕年限、BMI、基础FSH/LH/E2、AMH等指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表1。两组间Gn天数、Gn总用量、扳机日血清LH水平、E2值、内膜厚度、孕酮(progesterone,P)值、平均获卵数、平均优胚数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见下页表2。

表1 A、B两组患者基本临床资料比较

表2 A、B两组用药情况、扳机日指标、获卵数、优胚数比较

表3 A1、B1两组用药情况、扳机日指标、获卵数、优胚数比较

2.3 A1、B1两组移植周期结局比较

A1、B1两组间Gn天数、Gn总用量、扳机日血清LH水平、E2值、P值、内膜厚度、平均获卵数、平均优胚数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见下页表3。B1组胚胎种植率、临床妊娠率、活产率均高于A1组，早期流产率低于A1组,差异均无统计学意义(P>0.05)，详见下页表4。

表4 A1、B1两组胚胎种植率、临床妊娠率、早期流产率、活产率比较[例(%)]

3 讨论

本研究中，不孕症女性血清维生素D水平充足患者 21 例，仅占 6.46%;不足患者124例，占38.15%;缺乏患者 180 例，占55.39%;未发现血清维生素D过量患者。本研究提示血清维生素D水平缺乏在不孕女性中普遍存在，这一结果与之前的研究是一致的[4-7]。

多项研究显示，维生素D缺乏对不孕症女性进行IVF/ICSI-ET助孕结局有不良影响，维生素D缺乏女性进行IVF/ICSI-ET的临床妊娠率均低于维生素D充足的女性[8-12]。影响不孕症女性行IVF/ICSI-ET治疗结局的因素众多，目前认为胚胎质量和子宫内膜容受性是影响妊娠的主要因素。维生素D通过维生素D受体(Vitamin D receptor，VDR)来发挥其生物学功能，但其改善不孕症女性行IVF/ICSI-ET助孕治疗结局的具体作用机制并不明确。2009年Thill等[13]在蛋白水平发现女性卵巢中也存在VDR，主要在人类颗粒细胞的细胞核和细胞质中。后有研究证明，维生素D可以诱导卵巢激素的生成，如雌激素、孕激素等，对卵巢功能的调节起到一定的作用[14]。李红等[15]研究结果显示同源框基因 A10(Homebox A10 gene，HOXA10)mRNA在不明原因不孕患者中的表达低于正常育龄妇女，从而推测HOXA10基因可能参与内膜蜕膜化过程，并且在胚胎着床过程中发挥作用，HOXA10基因低表达可能影响胚胎着床。维生素D主要在子宫内膜的基质表达，通过VDR与视黄醇 X 受体(retinoid X receptor，RXR)结合形成二聚体，结合靶基因启动子区域的维生素D效应元件(Vitamin D response element，VDRE)增强 HOXA10基因的表达，提高子宫内膜容受性，有利于胚胎着床。妊娠早期，维生素D可能通过调控母胎界面细胞因子，维持母体辅助性T细胞(helper T cell，Th)1/ Th2的平衡，减少Th1细胞增生，限制其细胞因子的生成及免疫杀伤作用，增加Th2细胞及细胞因子的产生，降低外周血自然杀伤细胞毒性，增强免疫耐受，从而在胚胎植入过程中起到保护作用[16]。

Chu等[17]进行的一项Meta 分析显示，维生素D水平与IVF妊娠率呈正相关，并提出维生素D缺乏和不足可能是影响不孕女性IVF/ICSI-ET治疗结局的重要因素。 Zhao等[18]2018年进行的一项Meta 分析，研究共包括9项(3项IVF研究、1项ICSI研究、3项IVF/ICSI研究和2项卵母细胞捐赠研究)，涵盖了2 254对夫妇行IVF/ICSI后的临床妊娠率，共有1 112个妊娠周期。均提示缺乏维生素D与IVF/ICSI-ET后活产率降低有关。并建议对维生素D水平不足的不孕女性进行维生素D的补充，可能会有益于其IVF/ICSI-ET的临床结局，提高临床妊娠率。但补充多少的维生素D量合适，以及补充时间，均无参考标准。

本研究采用前瞻性随机对照研究，对试验组维生素D缺乏的不孕女性，进行维生素D补充，结果显示B组的胚胎种植率、临床妊娠率、活产率均明显高于对照组，提示维生素D补充可能有益于IVF/ICSI-ET助孕结局，但两组间差异均无统计学意义，这可能与样本量不足有关，同时本研究也存一定的不足：单中心研究，没有去除男方精子质量因素等。

目前，有关维生素D缺乏的不孕女性是否有必要补充及如何补充维生素D的研究非常有限。Aflatoonian等[19]2014年进行了一项随机对照研究，对行冻融胚胎移植的114例维生素D缺乏的不孕症患者随机分组，其中57例患者移植前每周补充50 000 U维生素D，治疗6～8周，研究显示维生素D补充治疗并未提高冻融胚胎移植的妊娠率。Wehr等[20]2009年报道了对46例多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)进行给予每周20 000 U 维生素D治疗，24周后发现，约50%PCOS患者的月经稀发、闭经症状得到改善。Dastorani等[21]对进行IVF助孕治疗的PCOS患者补充维生素D，结果显示可改善PCOS患者胰岛素代谢以及体脂状况。Lerchbaum等[22]指出，维生素D补充治疗可能并不能大幅改善不孕症现状，但其治疗安全、经济，对不孕症治疗可起到辅助作用。

综上所述，不孕症女性维生素D水平普遍不足或缺乏，众多研究提示血清维生素D缺乏，对不孕女性行IVF/ICSI-ET临床妊娠率有不良影响，但其具体机制尚不清楚。本研究提示对维生素D缺乏的不孕症女性补充维生素D可能有益于其IVF/ICSI-ET助孕结局。但这一结果仍需要多中心大样本随机对照研究来证实。