开建荣，王彩艳，石欣，李彩虹，杨春霞，王晓菁

(宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏 银川，750002)

枸杞是我国传统的药食同源食品[1]，宁夏枸杞是唯一载入《2020年版中国药典》的品种，枸杞果实中富含微量元素、多糖、黄酮、甜菜碱、类胡萝卜素等多种功能营养成分[2-3]，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、调节血脂、降血压[4-7]等多重功效，在我国保健行业和医药行业发挥着重要作用。枸杞作为宁夏地区特色优势产业，已成为我区生态治理、劳动力就业、脱贫富民的支柱产业，其产量、消费量和出口量均居世界首位。目前，枸杞中功能成分的研究主要集中在甜菜碱、多糖等有机成分，或者不同产区枸杞中功能营养成分差异性研究[8-9]。近年来，有很多有关中药材无机元素影响其质量的研究[10-12]，这些研究表明，无机元素不仅直接或间接影响中药材的生长发育[13]，还影响药材中次生代谢产物的积累[12]，从而影响药材的药效作用，因矿物元素能够反映农产品生长的土壤环境、元素的种类和含量差异，具有一定地理标志特征，因此，矿物元素分析技术是被公认的植源性食品产地判别中最有效、最有前景的方法之一[14-17]，已被广泛应用。但目前溯源指标稳定性及机理探讨的相关研究较为缺乏，不稳定的溯源指标不但增加了溯源的工作量，也可能影响稳定溯源模型的建立，因此，本研究以中宁枸杞为研究对象，检测分析不同成熟期枸杞中55种矿物元素含量，阐明不同成熟期枸杞矿物元素含量的变化特征，研究结果可为枸杞产地溯源提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

混合标准溶液(包括As、Ba、B、Bi、Be、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Li、Mg、Mn、Eu、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Tl、V、Zn、Ge、Mo、Nb、Ca、Ce、Dy、Gd、Ho、Nd、Pr、Sm、Tb、Lu、Tm、Y、Yb、Er、La、Sc、Sb、Sn、Ti、Zr、Pd、Ag、Ta、Hf、W、Ir、Pt、Ga、Hg元素，共计55种元素),美国 Perkin Elmer公司;硝酸为优级纯，德国 Merck 公司。

标准物质GBW10047(生物成分分析标准物质——胡萝卜),中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所研制。

1.2 仪器与设备

ELAN DRC-e ICP-MS仪，美国 Perkin Elmer公司；Mars6 Xpress微波消解仪，美国 CEM 公司；AL104电子天平，梅特勒-托利多公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集

枸杞样品采自宁夏中宁同3个基地(37°19′10″～37°28′19″ N，105°34′25″～105°55′8″ E)二茬果成熟时期的5个成熟阶段(7 d幼果期、14 d青果期、21 d黄变前期、28 d黄变后期和35 d红熟期)果实。鲜样晒干，置于50 ℃烘箱中烘干，然后进行充分研磨，过100目筛后备用。

1.3.2 样品前处理

枸杞中元素测定方法参考文献[18]。采用微波消解法消解样品，具体操作步骤：称取0.500 0 g(精确到0.000 1 g) 枸杞样品置于微波消解管中，加入硝酸10 mL，常温静置3 h后，放入微波消解仪中进行样品消解，选择温度控制，5 min爬升至120 ℃，保持10 min；5 min爬升至150 ℃，保持20 min；5 min爬升至185 ℃，保持30 min，消解完毕后冷却，轻轻拧开盖子，将微波消解管置于赶酸仪上120 ℃赶酸2 h，然后冷却至室温，用超纯水洗至50 mL刻度试管中，并用超纯水定容，摇匀；同时做试剂空白。

1.3.3 矿物元素含量测定

采用ICP-MS测定枸杞中元素含量。具体的工作条件：发生器功率为1 300 W；雾化器流量为0.95 L/min；等离子炬冷却气流量为17.0 L/min；辅助器流量为1.20 L/min；检测器模拟阶电压为-2 350 V；离子透镜电压为6.00 V。仪器测定枸杞样品及胡萝卜标准物质中55种元素，标准物质测定值在标准值范围内，仪器元素的检出限和定量限见表1。

表1 ICP-MS仪器测定矿物元素标准曲线、检出限和定量限Table 1 ICP-MS instrument determination of mineral elements standard curve, detection limits and limits of quantification

1.4 数据分析

使用SPSS 25.0 Duncan进行显著性方差分析(P<0.05，差异显著)；采用Origin 8.5进行绘图分析；采用SIMCA-P 进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 枸杞成熟过程中矿物元素变化规律

2.1.1 枸杞成熟过程中矿物元素含量分析

为了方便讨论，将55种元素按照其在枸杞生长过程中的作用分为微量元素、稀土元素、有害金属元素和其他元素，枸杞在5个生长阶段矿物元素含量值见表2。

枸杞果实中微量元素的含量与枸杞的药用价值密切相关，很多微量元素有害或无害是相对的，有益必需的微量元素，若改变其存在状态或浓度，就会产生毒害作用[19]。例如，V是植物生长非必需的微量元素，低浓度V会促进植物生长发育，但高浓度V对植物产生毒性作用[20]。对枸杞5个成熟阶段样品中的11种微量元素进行检测分析，并计算Fe/Mn值。由表2可知，各成熟期的干果中Cu、Co、B、Mg、Mn、Mo、Fe、Zn、Ca、Se、V元素含量范围分别为12.5～16.6、0.11～0.23、9.5～14.2、1 483～3 422、16.1～30.0、0.32～0.64、49.4～86.5、22.5～57.0、1 020～3 273、0.012～0.031、0.050～0.10 mg/kg。除Se元素外，其余10种微量元素在枸杞不同成熟阶段均具有显著性差异(P<0.05)。枸杞作为一种药食同源食品，是一种常用的中药材，中药的功效不是由单一成分的多少决定，而是由多种成分按照合理的比例共同作用的结果，中药中微量元素的生理作用也不能从单一元素的绝对含量来分析，而应该结合不同元素的比例来看[21]，牛艳等[22]研究认为，适当的Fe/Mn值可能是宁夏中宁枸杞品质较好的重要原因之一，有研究表明，中药药性从温热到寒凉与Fe/Mn值呈正相关，热药的Fe/Mn值在0.7左右，温药为3.0左右[23]。根据本文中中宁枸杞果实中Fe/Mn值为2.35～3.70，红熟期的Fe/Mn值最高，可以确定中宁枸杞属于温药。

稀土元素是元素周期表中 15 种镧系元素、Sc和Y的总称，在植物体内相对比较稳定。稀土元素以不同形态广泛分布于土壤中，通常主要以难溶残渣态形式存在，但也存在可被植物吸收利用的水溶态、可交换态和有机态[24]。植源性农产品中稀土元素来源与地域环境具有较强的关联性，近年来，稀土元素已被广泛应用于农产品产地溯源研究中。本文对不同成熟期中宁干果枸杞中的16种稀土元素含量进行了分析(表2)，可见各成熟阶段的枸杞中16种稀土元素含量均较低，其中La、Ce、Nd轻稀土元素及Sc、Y元素含量在枸杞中的分布较其他稀土元素较为丰富。La元素含量最高，为0.063～0.18 mg/kg，其次是Ce、Nd、Sc、Y元素，含量分别为0.035～0.095、0.014～0.035、0.015～0.033、0.013～0.020 mg/kg，之后是Pr、Eu、Yb、Dy、Er、Gd、Sm元素，含量为10-9数量级，Tb、Ho、Tm、Lu含量较低，为10-10数量级，枸杞中稀土元素显示出轻稀土元素富集、重稀土元素亏欠的特征，这与齐国亮等[25]的研究结果相同。利用ANOVA单因素方差分析比较了不同成熟阶段枸杞中稀土元素含量差异性，结果表明，除了Lu元素外，其余15种稀土元素在5个成熟阶段均存在显著性差异(P<0.05)。

对中宁枸杞中Pb、Cd、As、Hg、Cr、Ni、Ba、Tl、Sb、Sn 10种有害重金属元素含量分析结果表明，各成熟阶段的干果中Cr、Ni、Ba元素含量较高，为mg/kg级；Pb含量次之，含量为0.083～0.28 mg/kg，含量最低的元素为Hg、Tl含量较低，为μg/kg级，比Cd、As、Sb、Sn元素含量低10倍左右。不同成熟阶段枸杞中有害金属元素含量单因素方差分析结果表明，除了Hg、Tl元素，其他8种元素含量在不同成熟阶段枸杞中差异显著(P<0.05)。目前，中药材重金属超标现象依然严重，《中国药典》中规定了重金属残留限量：铅、镉、砷、汞、铜分别为5.0、1.0、2.0、0.2、20 mg/kg，中宁枸杞在整个成熟阶段铅、镉、砷、汞均未超过限量标准，Cu最高含量为16.6 mg/kg，也低于限量值，中宁枸杞质量属安全级。我国现行的有关枸杞重金属元素限量的相关标准，仅对As、Cd、Pb、Hg、Cu的限量值进行了规定，并未对其他元素含量做明确要求，但Ni、Cr、Tl等重金属的摄入对人体危害严重，如镍元素摄入过量会损害人的肝脏和心肺功能[26]。因枸杞为药食同源食品，日摄入量较大，需加强枸杞中重金属的监测。

中宁枸杞中Bi、Be、Sr、Li、Rb、Cs、Ti、Zr、Nb、Pd、Ag、Hf、Ta、W、Ir、Pt、Ga、Ge 18种元素含量分析结果显示，Sr、Rb元素含量较高，分别为7.2～20.6 mg/kg和11.1～15.2 mg/kg，Ti、Li含量分别为2.54～7.69 mg/kg和1.57～1.94 mg/kg，Ga、Cs、Zr、Ag元素含量较上述元素低100倍，Nb、Pt、Ir、W、Ta、Bi、Be、Pd、Ge、Hf含量较低，为μg/kg级。18种元素在5个时期含量的方差分析结果显示，5个阶段枸杞中Be、Nb、Pd、Ta、Hf、Pt、Ge元素含量不存在显著差异(P>0.05)，其他11种元素均存在显著差异(P<0.05)。

根据以上分析结果，中宁地区5个成熟阶段枸杞中Cu、Co、B、Mg、Mn、Mo、Fe、Zn、Ca、V、La、Ce、Nd、Sc、Y、Pr、Eu、Yb、Dy、Er、Gd、Sm、Tb、Ho、Tm、Pb、Cd、As、Cr、Ni、Ba、Sb、Sn、Bi、Sr、Li、Rb、Cs、Ti、Zr、Ag、W、Ir、Ga 44种矿物元素在枸杞成熟阶段存在“时间差异”。

表2 不同成熟期枸杞中矿物元素含量 单位：mg/kg

2.1.2 枸杞成熟过程中矿物元素变化规律

对部分元素含量进行标准化处理(Pr、Eu、Yb、Dy、Er、Gd、Sm、Pb元素含量乘以10，Co、Mo、V、Cd、As、Sb、Tb、Ho、Tm、Lu、Sn、Cs、Zr、Ga元素含量乘以100，Se、Hg、Tl、Bi、Be、Nb、Pd、Ag、Ta、Hf、W、Ir、Pt和Ge元素含量乘以1 000；Sr、Rb元素含量除以10，Ca、Mg元素含量除以100)后，做图，见图1。

微量元素中，Cu、Co、B、Mg、Mn、Mo、Ca元素在5个成熟期基本呈降低的趋势，在幼果期/青果期达到最大值，在红熟期达到最低；Fe、Zn、V元素含量呈先降低后升高的趋势，Fe、V在幼果期达到最高，随后逐渐降低，在黄变前期/后期达到最低值，在红熟期又有所升高，达到次高值，Zn在幼果期达到次高值，随后降低在黄变后期达到最低值，Zn在红熟期急剧升高，达到最高值；Se元素在5个成熟阶段含量变化趋势不明显。

稀土元素中，Sc元素呈先升高后降低的趋势，在黄变前期达到最高值；枸杞对其他15种稀土元素在整个成熟阶段具有相同的吸收累积规律，即先降低后升高的趋势，在黄变前期/黄变后期达到最低值，在幼果期/青果期达到最大值。稀土元素总量也呈先降低后升高的趋势，在幼果期含量达到最高，在黄变前/后期达到最低值。有研究表明，稀土元素具有生物活性，可提高作物的产量影响植物生理和生物化学反应的进程对植物的生命活动是有益的[27]，而GB 2762—2005《食品中污染物限量》中规定了稻谷、玉米、小麦、绿茶等植源性食品中稀土元素总含量限量值为0.5～2.0 mg/kg，但在GB 2762—2017《食品中污染物限量》中又取消了食品中稀土元素的含量限值，中宁枸杞在整个成熟阶段稀土元素总含量在幼果期达到最高，为0.361 mg/kg，根据GB 2762—2005中的规定，中宁枸杞中稀土元素总量未超过限量值。

有害金属元素中，Pb、As、Hg、Sb、Tl、Sn元素在5个成熟期呈先降低后升高的趋势；Cd、Cr、Ni、Ba元素逐渐降低，并在后期趋于稳定，说明Cd、Cr、Ni、Ba、Sn元素的富集系数较低，或是从根茎部向枸杞果实的转运能力较弱。

其他元素中，枸杞对Bi、Be、Cs、Zr、Nb、Ag、Ta、Ge元素的吸收具有一致规律，即先降低后升高，枸杞中这些元素在黄变前期/黄变后期元素含量达到最低值；Sr、Rb、Ti、W、Ga元素具有一致的吸收规律，即枸杞在幼果期、青果期对这些元素具有较强的吸收作用，随着枸杞成熟，枸杞对这些元素的需求量减少，其含量逐渐降低；Li、Pd、Hf、Zr、Pt元素含量呈现先升高后降低的趋势，基本在黄变前期/黄变后期达到最大值。

A-微量元素；B-稀土元素；C-有害金属元素；D-其他元素图1 不同成熟阶段枸杞中微量元素、稀土元素、有害金属元素、其他元素含量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of contents of trace elements, rare earth elements, harmful metal elements and other elements in Lycium barbarum at different maturation stages

2.2 偏最小二乘法分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)枸杞中55种矿物元素

2.2.1 主成分及主因子提取过程分析

主成分分析是通过降维以达到简化分析过程的目的，原始指标的因子载荷和主成分得分图分别表明其对主成分的贡献程度和不同样本之间的联系与差异[28]。

对中宁枸杞5个成熟阶段中55种元素含量进行PLS-DA分析，结果列于表3，根据特征值大于1的原则，可提取出2个主成分，2个主成分的特征值分别为9.76、2.38，方差贡献率分别为65.1%和15.8%，累计方差贡献率为80.9 %。因此可以将PLS-DA的前2个主因子作为评价枸杞样品质量的综合变量，达到了对评价枸杞矿物元素含量指标的降维目的。

表3 PLS-DA的累计贡献率Table 3 Cumulative contribution rate of PLS-DA

2.2.2 基于PLS-DA的不同成熟阶段枸杞的分类

中宁枸杞5个成熟阶段中55种元素含量进行PLS-DA分析，构建不同成熟阶段枸杞的区分模型。该模型中R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2(cum)分别为0.936、0.977和0.912，说明建立的PLS-DA模型中2个主成分能有效解释5个成熟阶段之间的差异，且该模型具有一定的预测能力。图2为PLS-DA模型第一、二主成分得分图。可以看出，各成熟阶段样品群体有明显的聚集趋势，幼果期(YG)枸杞样品聚在第一象限，红熟期(HS)枸杞样品聚在第二象限，黄变前期(HBQ)和黄变后期(HBH)枸杞样品聚在第三象限，青果期(QG)枸杞样品聚在第四象限。

根据VIP值(图3)，可筛选出Sc(VIP:1.576 3)、Li(1.501 58)、Zn(1.450 72)、Ta(1.421 99)、Be(1.373 54)、La(1.325 38)、Se(1.305 46)、Sb(1.276 32)、Lu(1.251 62)、Pt(1.241 67)、Ni(1.199 67)、Ir(1.146 07)、Sr(1.135 21)、Hg(1.108 52)、Mo(1.100 46)、Bi(1.095 28)、Pb(1.046 19)、W(1.035 4)、Hf(1.034 67)、Yb(1.019 33)、Pd(1.008 18)、Sn(1.005 84)22种矿物元素作为中宁枸杞不同成熟阶段的有效区分指标。

图2 PLS-DA模型第一、二主成分得分图Fig.2 Score plot of first versus second components in PLS-DA

图3 PLS-DA模型VIP值Fig.3 The VIP plot of PLS-DA

3 结论

追踪中宁枸杞中55种矿物元素在整个成熟过程中的动态变化，发现枸杞在不同成熟阶段元素含量差异较大，44种矿物元素含量在不同成熟阶段具有显著差异(P<0.05)，且稀土元素显示出轻稀土元素富集、重稀土元素亏欠的特征。除Se元素外，其余54种矿物元素在整个成熟期有其各自的变化趋势，Cu、Co、B、Mg、Mn、Mo、Ca、Cd、Cr、Ni、Ba、Sr、Rb、Ti、W、Ga呈降低趋势，Fe、Zn、V、Pb、As、Hg、Sb、Tl、Sn、La、Ce、Nd、Y、Pr、Eu、Yb、Dy、Er、Gd、Sm、Tb、Ho、Tm、Lu、Bi、Be、Cs、Zr、Nb、Ag、Ta、Ge呈先降低后升高的趋势，Sc、Li、Pd、Hf、Zr、Pt呈先升高后降低的趋势。对中宁枸杞5个成熟阶段中55种元素含量进行PLS-DA分析，可提取出2个主成分，累计方差贡献率为80.9%，同时构建不同成熟阶段枸杞的区分模型，第一主成分、第二主成分得分图可以将5个成熟阶段的样品很好地区分开，同时可筛选出Sc、Li、Zn、Ta、Be、La、Se、Sb、Lu、Pt、Ni、Ir、Sr、Hg、Mo、Bi、Pb、W、Hf、Yb、Pd、Sn 22种矿物元素为中宁枸杞不同成熟阶段的有效区分指标。