何庆，郑素慧，秦南南，刘雪艳，关军锋，吴斌*，于永春

1(新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐，830052)2(新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆 乌鲁木齐，830091) 3(河北省农林科学院遗传生理研究所，河北 石家庄，050051)4(特克斯县农业技术推广中心，新疆 伊犁哈萨克自治州，835500)

红地球葡萄因果粒较大，果肉硬脆，营养丰富等优点，是市场最受欢迎的鲜食葡萄品种之一。采后葡萄会由于某些生理代谢的影响而迅速衰老,易出现软化、果粒碎裂和果梗失水、褐变等现象，严重影响葡萄的货架品质[1-2]。果实软化是评价果实销售商品性的重要指标之一，果实软化导致果实易受病原菌侵染，降低货架品质，缩短贮藏期及货架期。果实的软化与细胞壁成分和细胞壁降解酶[多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)、果胶甲酯酶(pectin methylesterase, PME)、纤维素酶(cellulase, Cx)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-Gal)]活性密切相关[3-4]，细胞壁结构和成分的变化是果实软化的主要原因[5]。细胞壁水解酶活性和微生物侵染使原果胶逐渐转化为果胶，从而使其硬度降低[6]。果实软化导致对病原菌的敏感性增加，果实细胞壁降解酶的敏感性增加[7]，果实软化也是消费者一直关注的问题。

水杨酸(salicylic acid，SA)是一种内源性信号分子[8]，近年来研究表明，外源SA可以延缓芒果[9-10]、小白杏[11]和猕猴桃[12]硬度下降，但关于采前SA是否可以调节葡萄细胞壁代谢延缓果实软化系统的报道较少，目前尚不清楚。

本文分析采前喷施SA对红地球葡萄细胞壁代谢的影响，探讨采前喷施SA处理延缓葡萄果实软化的作用机理，为SA在葡萄采后果实软化调控、延长货架期和保鲜中的应用提供理论及技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红地球葡萄采自昌吉三工镇葡萄种植园，采收后即运回新疆农业科学院冷库。在0 ℃预冷12 h后在(22±1) ℃条件下贮藏，选择大小均匀、色泽相近、果形端正、无机械损伤和无病虫害的果实作为实验材料。

SA(≥99.50%，分析纯)，天津科密欧化学试剂有限公司；多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP411),天根生化科技(北京)有限公司；Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒、TB®Premix Ex TaqTMII试剂盒，TaKaRa公司。

1.2 仪器与设备

UV-2600紫外可见分光光度计，天津森罗有限公司；核酸电泳仪，北京市六一仪器厂；PCR仪，德国耶拿分析仪器公司；核酸蛋白测定仪，德国Eppendorf公司；LightCycler®96实时定量荧光PCR仪，Roche公司。

1.3 实验方法

1.3.1 采前处理

选择长势一致、光照良好的葡萄果穗，基于前期试验结果[13]，分别于2019年7月下旬(膨大期)、8月下旬(转色期)和9月中旬预收期(采收前2 d)对葡萄果穗进行喷施SA处理，浓度为1.0 mmol/L SA(含体积分数0.05% Tween-80)，喷施相同体积的蒸馏水作CK组。每次处理需均匀喷施果面数次，每串果穗喷施药液约为200 mL，自然晾干，每个处理200串。采收预冷后于(22±1) ℃贮藏，4～5 串/筐，每天测定相关品质指标。

1.3.2 品质指标测定

硬度测定每个处理随机取3筐，每筐10个果实，使用GY-4型果实硬度计在果实赤道部位进行测定，探头直径为3 mm，刺入深度为10 mm，重复3次。按照公式(1)、(2)分别计算腐烂率和失重率：

(1)

(2)

每天随机取15串果实进行分级。分为5级，果梗没有褐变为0级，果梗褐变面积不超过总面积的1/4为1级，果梗褐变面积占总面积的1/4～1/2为2级，果梗褐变面积占总面积的1/2～3/4为3级，果梗变面积超过3/4为4级。按照公式(3)计算果梗褐变指数：

(3)

1.3.3 原果胶(protopectin,PP)、水溶性果胶(water soluble pectin,WSP)和纤维素含量测定

PP和WSP的含量参照GE等[4]的方法测定，样品溶液在530 nm处测定吸光度，以纯化的半乳糖醛酸为标准品。纤维素含量参考BU等[14]方法测定，样品溶液在620 nm处测定吸光度，使用纯化纤维素标准曲线计算PP、WSP含量和纤维素含量。

1.3.4 细胞壁代谢相关酶活性测定

PME活性的测定采用GE等[15]的方法，稍作修改。反应混合物由0.5 mL酶液、0.5 mL 10 g/L果胶和1.0 mL醋酸缓冲液(50 mmol/L, pH 5.5)组成，37 ℃ 水浴1 h后，加入1.5 mL 3, 5-二硝基水杨酸终止反应，沸水浴5 min。在540 nm测定吸光度。PME活性用U表示，其中1 U定义为1 h 1 g鲜重(FW)催化生成1 μg半乳糖醛酸的量，PME活性表示为U/g。

PG活性参考GE等[4]的方法测定，以半乳糖醛酸为标准，在540 nm测定吸光度。一个酶活性单位U定义为1 g鲜重1 h释放1 mg半乳糖醛酸所需的酶量，PG活性表示为U/g。

Cx采用GE等[4]的方法测定。反应混合物由酶液0.5 mL和1.5 mL 10 mg/mL羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose, CMC)组成。37 ℃水浴1 h后，加入1.5 mL 3, 5-二硝基水杨酸终止反应，沸水浴5 min。540 nm处测定吸光度。纤维素酶活性以U/g表示，其中1 U表示1 h 1 g FW催化生产1 mg还原糖的能力。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-Glu)活性参考GE等[4]的方法测定，β-Glu活性用U表示，其中1 U表示1 h 1 g FW生产1 mg葡萄糖的能力，β-Glu活性表示为U/g。

β-Gal活性参考GE等[15]的方法测定。β-Gal的反应混合物包括0.5 mL 0.1 mol/L乙酸钠(pH 5.2)，0.5 mL 3 mmol/L对硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷和0.5 mL酶液。37 ℃水浴30 min后，加入2.0 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液终止反应。400 nm处测定吸光度。β-Gal活性单位表示为U/g。

1.4 荧光定量PCR检测果实软化相关基因PME、PG、β-glu和β-Gal相对表达量

(1)葡萄果肉或果皮组织总RNA的提取

取葡萄果肉或果皮液氮研磨，按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根DP411)说明书提取总RNA。提取的RNA经Biospectrometer(Eppendorf,德国)测定OD值以及电泳检测合格后-80 ℃保存备用。

(2)cDNA合成

参照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 反转录试剂盒说明书进行。反应体系及反应程序按照郑素慧等[16]的方法进行。

(3)mRNA定量分析

VvPME、VvPE、VvPG、Vvβ-Glu和Vvβ-Gal和VvActin基因定量引物采用DNAman 6.0根据国际生物技术信息中心检索数据库(NCBI)中已经登陆的VvPME(AY043232.1)、VvPG(XM_003632610.3)、Vvβ-Glu(NM_001281232.1)、Vvβ-Gal(XM_002282096.3)和VvActin(XM_002279636.3)氨基酸保守序列设计引物，并将设计好的引物通过Oligo 6.0软件进行检测，避免引物错配，二聚体，发夹结构等。再送上海生工公司进行合成。荧光定量qPCR参照TB Green®Premix Ex TaqTMII试剂盒说明书进行，每个处理设3次重复，以VvActin基因作为内参，采用ABI7500分析软件中2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。荧光定量PCR反应体系和反应条件按照程玉豆等[17]的方法进行。

1.5 数据分析

使用Sigma Plot 12.5软件作图，SPSS 22.0进行数据方差分析(ANOVA)并利用Duncan法进行均值比较。*表示P<0.05差异显著，**表示P<0.01差异极显著。

2 结果与分析

2.1 采前喷施SA对红地球葡萄硬度的影响

如图1所示，在0～7 d葡萄果实的硬度呈下降趋势。0 d时1.0 mmol/L 采前喷施SA处理组硬度为14.86 N，CK组为12.50 N，采前喷施SA处理组硬度是CK组的1.19倍(P<0.01)，7 d时采前喷施SA处理组硬度为12.94 N，CK组为10.05 N，采前喷施SA处理组硬度是CK组的1.29倍(P<0.01)。在0～7 d SA处理组与CK组存在显著性差异。说明采前喷施SA处理能够提高果实硬度(0 d)，延缓果实采后硬度下降，维持果实的品质。

图1 采前喷施SA处理对红地球葡萄硬度的影响Fig.1 Effect of pre-harvest spraying SA treatment on firmness of red globe grape 注：*表示同一贮藏时间2组间差异显著(P<0.05)， **表示同一贮藏时间2组间差异极显著(P<0.01)(下同)

2.2 采前喷施SA对红地球葡萄失重率、腐烂率和果梗褐变指数的影响

如图2-a所示，在贮藏期间，葡萄的失重率呈上升趋势。5 d时CK组0.591%，采前喷施SA处理组为0.367%，CK组失重率是采前喷施SA组的1.61倍。6 d时CK组0.91%，采前喷施SA处理组为0.51%，CK组失重率是的采前喷施SA处理组1.787倍，采前喷施SA处理组与CK组0～2 d无显著性差异，3～7 d存在显著性差异(P<0.05)，说明采前喷施SA处理能够延缓果实失重率的上升。

如图2-b所示，在贮藏期间，果实的腐烂率呈上升趋势。CK组2 d开始出现腐烂，SA处理组5 d开始发生腐烂，采前喷施SA处理组的腐烂率低于CK组，7 d时CK组腐烂率15.53%，采前喷施SA处理腐烂率2.20%，CK组腐烂率是采前喷施SA处理组的7.06倍，在0～7 d存在显著性差异(P<0.01)，说明采前喷施SA处理前期可以延缓果实腐烂的发生，后期可以抑制腐烂率的上升。

如图2-c所示，在贮藏期间，果梗褐变指数呈上升趋势。7 d时CK组果梗褐变指数达到86.00%，采前喷施SA处理组的果梗褐变指数为57.33%，CK组是SA处理组的1.50倍，采前喷施SA处理组的果梗褐变指数低于CK组，5～7 d存在显著性差异(P<0.05)，说明采前喷施SA处理可以延缓果梗的褐变。

研究结果与弓德强等[10]的研究结果一致。SA处理可以延缓果实贮藏期间品质下降，延长果实的货架期。

a-失重率；b-腐烂率；c-果梗褐变指数图2 采前喷施SA处理对红地球葡萄失重率、 腐烂率和果梗褐变的影响Fig.2 Effects of preharvest spraying SA treatment on weight loss rate, decay rate and browning index of fruit stem of red globe grape

2.3 采前喷施SA处理对红地球葡萄PP、WSP和纤维素含量的影响

PP含量在0～7 d呈下降趋势(图3-a)，采前SA处理组PP含量高于CK组(P<0.05)，0 d时SA处理组PP含量是CK组的1.25倍，7 d时SA处理组PP含量是CK组的1.37倍。说明采前喷施SA可以促进葡萄果实PP的合成，在采后贮藏过程中可以延缓PP含量下降。

WSP含量在0～7 d呈上升趋势(图3-b)，采前SA处理组WSP含量低于CK组(P<0.05)，4 d时CK组WSP含量是SA处理组的2.16倍，7 d时CK组WSP含量是SA处理组的1.87倍，说明采前喷施SA可以延缓WSP含量上升。

纤维素含量在0～7 d呈下降趋势(图3-c)，采前SA处理组纤维素含量高于CK组(P<0.05)，2 d时SA处理组纤维素含量是CK组的1.42倍，5 d时SA处理组纤维素含量是CK组的1.39倍，说明采前喷施SA可以提高葡萄果实纤维素的合成，在采后可以延缓纤维素降解。

通过相关性分析(表1)，硬度与PP(CK:r2=0.906，SA:r2=0.926)和纤维素含量(r2=0.902，r2=0.923)呈显著呈正相关(P<0.01)，与WSP含量(r2=-0.807，r2=-0.850)呈显著负相关(P<0.05)。PP、WSP和纤维素含量与葡萄果实硬度密切相关，说明SA处理可以通过延缓PP和纤维素含量的下降、WSP含量的上升，延缓葡萄果实硬度的下降。

a-PP含量；b-WSP含量；c-纤维素含量图3 采前喷施SA处理对红地球葡萄PP、WSP和纤维素含量的影响Fig.3 Effects of pre-harvest spraying SA treatment on PP、 WSP and cellulose content of red globe grape

2.4 采前喷施SA对红地球葡萄PG活性及基因表达量的影响

果实PG活性呈先上升后下降趋势(图4)，在贮藏期间，采前SA处理组PG活性低于CK组(P<0.05)，2 d时CK组PG活性是SA处理组的2.14倍，6 d时CK组PG活性是SA处理组的1.71倍，通过相关性分析(表1)，PG活性与硬度呈显著负相关(r2=-0.572，r2=-0.866)。VvPG基因相对表达量总体呈先上升再下降的趋势(图4)，5 d时CK组VvPG基因大量表达，是SA组的4.19倍(P<0.01)，1～2 d和4～7 d SA组VvPG基因表达量低于CK组(P<0.05),说明采前喷施SA可以延缓PG活性上升，抑制VvPG基因表达，与ALRASHDI等[18]研究结果一致。

a-PG活性；b-VvPG基因相对表达量图4 采前喷施SA处理对红提葡萄PG活性及基因 表达量的影响Fig.4 Effect of preharvest spraying SA treatment on PG activity and gene expression of red grape

2.5 采前喷施SA对红地球葡萄PME活性及基因表达量的影响

PME在决定果胶含量中起重要作用[19]。PME活性在0～7 d呈先上升后下降的趋势(图5)，采前SA处理组PME活性低于CK组(P<0.05)，2 d时CK组PME活性是SA处理组的1.7倍，5 d时CK组VvPME活性是SA处理组的1.56倍。说明采前喷施SA可以延缓PME活性上升。

VvPME基因相对表达趋势与PME活性变化趋势相近(图5)，总体呈先上升后下降的趋势，5 d时CK组VvPME基因大量表达，是SA组的4.61倍(P<0.01)，2～7 d CK组VvPME基因相对表达量快速上升，显著高于SA组(P<0.05)。通过相关性分析(表1)，PME活性与PP含量呈显著负相关(r2=-0.924，r2=-0.885)，与WSP含量呈显著正相关(r2=0.765，r2=0.870)，PG活性与PME活性呈显著正相关(r2=0.856，r2=0.973)，说明PG与PME在果实软化过程中存在协同作用。

a-PME活性；b-VvPG基因相对表达量图5 采前喷施SA处理对红地球葡萄PME活性及基因 表达量的影响Fig.5 Effect of preharvest spraying SA treatment on PME activity and gene expression of red globe grape

2.6 采前喷施SA对红地球葡萄β-Glu活性及基因相对表达量的影响

β-Glu活性呈先上升后下降趋势(图6)，在0～7 d CK组β-Glu活性高于SA处理组(P<0.05)，4 d时CK组β-Glu活性是SA处理组的1.17倍，7 d时CK组β-Glu活性是SA处理组的1.14倍。

Vvβ-Glu基因相对表达量呈下降趋势(图6)，0～7 d SA组Vvβ-Glu基因相对表达量低于CK组，0～7 d SA组Vvβ-Glu基因相对表达量与CK组存在显著性差异(P<0.05)。说明采前喷施SA处理可以抑制Vvβ-Glu基因表达，延缓β-Glu活性上升。通过相关性分析(表1)，β-Glu 活性与PP和纤维素含量呈显著负相关，与WSP含量呈显著正相关，说明采前喷施SA可以通过延缓β-Glu 活性上升，进一步延缓PP和纤维素降解。

图6 采前喷施SA处理对红地球葡萄β-Glu 活性及基因表达量的影响Fig.6 Effect of preharvest spraying SA treatment on β-Glu activity and gene expression of red globe grape

2.7 采前喷施SA对红地球葡萄β-Gal活性及基因相对表达量的影响

β-Gal活性呈先上升后下降趋势(图7)，在贮藏期间，CK组β-Gal活性高于SA处理组，0～5 d差异显著(P<0.05)，0 d时CK组β-Gal活性是SA处理组的1.24倍，4 d时CK组β-Gal活性是SA处理组的1.36倍。Vvβ-Gal基因相对表达量变化趋势与β-Gal活性变化趋势相近，总体呈先上升后下降趋势(图7)，贮藏期间SA组Vvβ-Gal基因表达量低于CK组。1、6和7 d CK组极显著高于SA组(P<0.01)，CK组Vvβ-Gal基因相对表达量是SA组的3～4倍。通过相关性分析(表1)，β-Gal活性与果实硬度呈显著负相关。说明采前喷施SA可以通过抑制Vvβ-Gal基因表达，延缓β-Gal活性上升，硬度下降。

图7 采前喷施SA处理对红地球葡萄β-Gal 活性及基因表达量的影响Fig.7 Effect of preharvest spraying SA treatment on β-Gal activity and gene expression of red globe grape

2.8 采前喷施SA对红地球葡萄Cx活性的影响

Cx活性变化趋势与PG酶活性变化趋势相近(图8)，在0～6 d Cx活性呈上升趋势，6～7 d呈下降趋势。2～7 d CK组Cx活性显著高于SA处理组(P<0.05)，3 d时CK组Cx活性是SA处理组的1.75倍。说明采前喷施SA可以延缓Cx活性上升。Cx活性升高的同时纤维素含量下降，通过相关性分析(表1)，Cx活性与纤维素含量呈显著负相关(r2=-0.967，r2=-0.955)。说明采前喷施SA可以通过延缓Cx活性升高来延缓纤维素分解。

图9 采前喷施SA处理对红地球葡萄Cx活性的影响Fig.9 Effect of preharvest spraying SA treatment on Cx activity of red globe grape

表1 红地球葡萄硬度与细胞壁成分及细胞壁代谢相关酶活性之间的相关性分析Table 1 Correlation analysis of red globe grape firmness with cell wall components and cell wall metabolism-related enzyme activities

3 讨论

SA能延缓多种园艺产品的采后成熟衰老进程，延长果实的货架寿命，在果实贮藏保鲜中具有较好的应用前景[20-21]。研究发现采前喷施1.0 mmol/L SA可以延缓红提葡萄果实硬度下降。这可能是因为大分子物质逐步分解成分子质量较小的物质，使得分子间的空隙加大，细胞壁结构被破坏导致的。研究发现采前喷施1.0 mmol/L SA处理对红提葡萄的腐烂、失重率和果梗褐变指数有明显的抑制作用，与前人使用SA在芒果[10]和小白杏[11]中的研究结果一致。

果实软化主要是果胶质、纤维素在细胞壁相关酶作用下降解导致果实硬度下降[22]。果胶、纤维素含量决定了采后果实的质地，在PME、β-Gal、PG和Cx等细胞壁代谢酶作用下会使细胞壁物质发生降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化。果实软化过程中，PP在细胞壁水解酶的作用下逐渐降解为WSP和果胶酸，由水不溶性向可溶性转变，伴随PP和纤维素的降解导致果实硬度下降[23]。研究发现采前喷施SA可以延缓PP和纤维素含量下降，WSP含量上升。

PG参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化，β-Glu主要是改变果胶分子相互作用，导致细胞壁的完整性下降[24]。研究发现，采前喷施SA处理可以抑制VvPG、VvPME、Vvβ-Glu和Vvβ-Gal基因表达，采前喷施SA处理组基因表达量低于CK组。延缓PG、PME、Cx、β-Glu和β-Gal活性上升，采前喷施SA处理组PG、PME、Cx、β-Glu和β-Gal活性低于CK组。说明细胞壁代谢关键酶活性和基因表达受到SA的影响。细胞壁代谢关键酶活性上升会加速细胞壁物质的降解，导致果实中WSP含量上升，PP和纤维素含量下降，而采前SA处理抑制了细胞壁代谢关键酶活性，延缓WSP含量的上升和PP、纤维素含量的下降，达到延缓葡萄果实硬度下降，维持葡萄采后贮藏品质，延长货架期。与GE等[4, 15]在枣和苹果研究结果，通过抑制PG、PME、Cx和β-Gal等酶活性减缓果实硬度下降的结果一致。

综上分析表明，采前喷施SA可以影响细胞壁代谢，抑制细胞壁代谢基因表达，延缓细胞壁代谢相关酶活性上升，延缓红地球葡萄果实细胞壁物质的降解，从而延缓采后葡萄果实的软化。

4 结论

采前喷施SA可通过抑制葡萄果实中VvPG、VvPME、Vvβ-Glu和Vvβ-Gal基因的表达，延缓PG、PME、Cx、β-Glu、β-Gal活性和WSP含量上升，PP和纤维素降解，达到有效延缓葡萄果实硬度下降的效果，减少葡萄采后软化和腐烂等问题造成的经济损失，提高了葡萄果实采后食用安全性。