刘立山 周 瑞 吴建平* 郎 侠 王彩莲

(1.甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，甘肃省牛羊种质与秸秆饲料化重点实验室，兰州 730070；2.西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730070)

随着现代养殖技术的不断发展，开发安全可靠的抗生素天然替代物成为当今饲料添加剂研究的重点和难点。近年来，天然活性物饲料添加剂的开发成为当今研究的热点[1]。植物精油作为天然抗生素替代品，已经作为饲料添加剂用于改善饲料利用率以及动物健康，受到业内人士的广泛关注。很多生产者期望通过应用植物精油产品直接抑制病原菌来替代饲用抗生素，然而植物精油由于其成分复杂多样，对其功能性物质的影响较大，因此关于植物精油作用机理的研究比较困难。研究发现，在肉鸡饲粮中添加香芹酚可以降低大肠杆菌的数量，提高乳杆菌的数量[2]，添加百里香酚可以降低肉鸡肠道中大肠杆菌和产气荚膜梭菌的数量，减轻肠道损伤[3]。在荷斯坦奶牛饲粮中添加牛至精油(有效成分为香芹酚和百里香酚)能够使奶牛乳房炎发病率降低2%，腹泻发病率降低10%[4]，还能显著提高犊牛的体尺、日采食量和日增重[5]，并且可以改善瘤胃菌群结构，显著提高瘤胃中纤维素酶和胃蛋白酶的活性[6]。由于目前大量的研究主要集中在植物精油的开发与应用，然而植物精油中的化学成分众多，有效组分复杂。就香芹酚和百里香酚而言，有研究表明其可以刺激肉鸡消化液的分泌，提高内源消化酶的活性，增强肠道的消化吸收功能[7]，但是对反刍动物是否具有相同的功能，目前还未见报道。本试验选择香芹酚和百里香酚为研究对象，分析其作为饲料添加剂对绵羊养分表观消化率、瘤胃发酵特性及纤维降解菌数量的影响，以期为今后的抗生素替代产品的开发与选择提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验动物、基础饲粮及饲养管理

选取9只1岁左右的健康且体况和体重[(56.68±3.14) kg]相近装有永久瘤胃瘘管的小尾寒羊公羊，单笼饲养。基础饲粮参照NRC(2007)60 kg生长公羊日增重为250 g/d时的营养需要配制，精粗比为37.5∶62.5，基础饲粮组成及营养水平见表1。饲粮每天分2次(07:00和19:00)等量饲喂，自由饮水。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

续表1项目 Items含量 Content钙 Ca 0.41磷 P0.27

1.2 试验设计及样品采集

将9只瘘管羊随机分为3组，采用3个重复的3×3拉丁方设计，进行3期饲养试验。对照组(CON组)饲喂基础饲粮，试验1组(T1组)在基础饲粮精料中添加2 g/d香芹酚(香芹酚纯度为87.5%)，试验2组(T2组)在基础饲粮精料中添加2 g/d百里香酚(百里香酚纯度为93.6%)。每期20 d，预试期5 d，正试期15 d。从正试期第10天开始，连续5 d采用全收粪法进行消化代谢试验，记录采食量和排粪量，测定养分表观消化率；正试期最后1天在采食前(0 h)以及采食后1、3、5、7 h采集瘤胃液，立即用HI98103型笔式酸度计(北京泰亚赛福有限公司)测定瘤胃液pH；瘤胃液经4层灭菌纱布过滤，滤液装于经高压灭菌的采样管内，-20 ℃保存，用于测定发酵参数。

1.3 测定指标及测定方法

1.3.1 表观消化率测定

消化试验期间，每天采集少量精料和粗料，按饲喂比例混合均匀，粉碎通过0.45 mm筛，测定饲粮中干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的含量。将采集的粪样在65 ℃烘干，回潮24 h后测定初水分，粉碎通过0.45 mm筛，分析粪样中DM、CP、NDF和ADF的含量。饲粮及粪样中的养分测定参照张丽英[8]的方法进行。养分表观消化率计算公式如下：

干物质表观消化率(DMD)=(饲粮干物质摄入量-粪便干物质排放量)/饲粮干物质摄入量；粗蛋白质表观消化率(CPD)=100×(饲粮粗蛋白质摄入量-粪便粗蛋白排放量)/饲粮粗蛋白质摄入量；中性洗涤纤维表观消化率(NDFD)=100×(饲粮中性洗涤纤维摄入量-粪便中性洗涤纤维排放量)/饲粮中性洗涤纤维摄入量；酸性洗涤纤维表观消化率(ADFD)=100×(饲粮酸性洗涤纤维摄入量-粪便酸性洗涤纤维排放量)/饲粮酸性洗涤纤维摄入量。

1.3.2 瘤胃发酵参数测定

瘤胃液pH用HI98103型笔式酸度计(北京泰亚赛福有限公司)测定；氨态氮(NH3-N)浓度使用苯酚-次氯酸钠比色法[9]测定；微生物蛋白(MCP)浓度采用试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)测定；挥发性脂肪酸(VFA)浓度参照文献[10]的方法采用气相色谱仪(GC-2010 Plus，岛津，日本)测定。

1.3.3 瘤胃纤维降解菌数量测定

瘤胃微生物特异性引物见表2，白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的引物参照周瑞等[11]，黄色瘤胃球菌的引物参照Koike等[12]。所用引物均由上海生物工程有限公司合成。

表2 瘤胃微生物qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for qPCR of rumen microorganisms

微生物总DNA的提取利用天根(北京)粪样DNA提取试剂盒进行。微生物数量利用Light Cycler®480 Ⅱ型荧光定量基因扩增仪采用荧光定量PCR(qPCR)比较阈值法进行测定。PCR反应体系及反应参数参照Roche试剂盒(Gat.No.06402712001)说明书进行。PCR反应体系(20 μL)为：Master Mix 10 μL，模板2 μL(20 ng)，上、下游引物各0.6 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反应参数为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸10 s，45个循环。目的菌数量以每个样品中每毫升16S rRNA或18S rRNA基因拷贝数(拷贝数/mL)表示[13]。

1.4 数据统计与分析

数据采用SPSS 19.0软件的one-way ANOVA和GLM程序进行方差分析，以P<0.05作为差异显著的判断标准。

2 结 果

2.1 香芹酚和百里香酚对绵羊养分表观消化率的影响

香芹酚和百里香酚对绵羊养分表观消化率的影响见表3。结果显示，3组间试验羊的采食量无显著差异(P>0.05)，但CON组的排粪量显著高于其他2组(P<0.05)。T1组的DMD、CPD显著高于CON组(P<0.05)，T2组的DMD、CPD与CON组无显著差异(P>0.05)。各组间NDFD、ADFD无显著差异(P>0.05)。

表3 香芹酚和百里香酚对绵羊养分表观消化率的影响Table 3 Effects of carvacrol and thymol on nutrient apparent digestibility of sheep

2.2 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液pH及MCP、NH3-N浓度的影响

香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液pH及MCP、NH3-N浓度的影响见表4。结果显示，随着采食后时间的延长，瘤胃液pH先降低后升高。采食后1、3 h时，T1组pH显著低于CON组(P<0.05)；采食后3 h时，T1、T2组pH与CON组相比无显著变化(P>0.05)；采食后5、7 h时，T1组pH显著低于T2组(P<0.05)。采食后0、1 h时，T1、T2组MCP浓度显著高于CON组(P<0.05)；采食后3、7 h时，T1组MCP浓度显著高于其他2组(P<0.05)；采食后5 h时，T1组MCP浓度显著高于CON组(P<0.05)，但与T2组无显著差异(P>0.05)。采食后1 h时，T1组NH3-N浓度显著高于CON组(P<0.05)，CON组NH3-N浓度显著高于T2组(P<0.05)；采食后3、7 h时，CON组NH3-N浓度显著高于其他2组(P<0.05)。从平均值看，T1组pH显著低于其他2组(P<0.05)，MCP浓度显著高于其他2组(P<0.05)，NH3-N浓度显著低于CON组(P<0.05)。

表4 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液pH及MCP、NH3-N浓度的影响Table 4 Effects of carvacrol and thymol on pH, MCP and NH3-N concentrations in rumen fluid of sheep

2.3 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液VFA组成的影响

香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液VFA浓度的影响见表5。结果显示，随着采食后时间的延长，总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸比例先升高后降低。采食后0、1、3、5 h时，CON组TVFA浓度显著低于T1、T2组(P<0.05)；采食后7 h时，CON、T1、T2组TVFA浓度无显著差异(P>0.05)。采食后1、3 h时，T2组乙酸比例显著高于CON组(P<0.05)，而在采食后7 h时，T2组乙酸比例显著低于CON组(P<0.05)。采食后3 h时，T1组丙酸比例显著低于CON组(P<0.05)；采食后5 h时，T1组丙酸比例显著高于其他2组(P<0.05)。采食后0、1 h时，T2组丁酸比例显著低于T1、CON组(P<0.05)；采食后3 h时，T1组丁酸比例显著低于T2、CON组(P<0.05)；采食后5 h时，CON组丁酸比例显著高于T1、T2组(P<0.05)。采食后0、1、7 h时，CON、T1、T2组乙酸/丙酸值无显著差异(P>0.05)；采食后3 h时，T1组乙酸/丙酸值显著高于CON组(P<0.05)，与T2组无显著差异(P>0.05)；采食后5 h时，CON组乙酸/丙酸值显著高于T1、T2组(P<0.05)，T1组乙酸/丙酸值最低(3.50)。从平均值看，T1、T2组TVFA浓度均显著高于CON组(P<0.05)，T2组丁酸比例显著低于其他2组(P<0.05)，乙酸比例、乙酸/丙酸值各组间无显著差异(P>0.05)。

表5 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液VFA组成的影响Table 5 Effects of carvacrol and thymol on VFA composition in rumen fluid of sheep

2.4 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液纤维降解菌数量的影响

香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液纤维降解菌数量的影响见表6。结果显示，采食后不同时间瘤胃液纤维降解菌数量变化各异。采食后1、5 h时，CON组黄色瘤胃球菌数量显著低于T1组(P<0.05)；采食后3 h时，CON组黄色瘤胃球菌数量显著高于T2组(P<0.05)。采食后0、1、3 h时，CON和T1组白色瘤胃球菌数量显著高于T2组(P<0.05)；采食后5、7 h时，CON组白色瘤胃球菌数量显著高于T1组(P<0.05)。采食后0、1、3、5 h时，CON组产琥珀酸丝状杆菌数量显著低于T1组(P<0.05)，与T2组无显著差异(P>0.05)；采食后7 h时，T1组产琥珀酸丝状杆菌数量显著高于T2组(P<0.05)，与CON组无显著差异(P>0.05)。从平均值来看，T1组黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌数量均显著高于CON和T2组(P<0.05)，CON组白色瘤胃球菌数量显著高于T1和T2组(P<0.05)。

表6 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃纤维降解菌数量的影响Table 6 Effects of carvacrol and thymol on cellulose-decomposed bacteria counts in rumen fluid of sheep

3 讨 论

3.1 香芹酚和百里香酚对绵羊养分表观消化率的影响

养分表观消化率是反映饲粮中养分被动物消化利用的难易程度。研究发现，饲粮中添加香芹酚能够提高肉鸡肠道干物质消化率[14]。在绵羊饲粮中添加以香芹酚和百里香酚为主要活性组分的牛至精油后，显著提高了瘤胃中脂肪酶活性和瓣胃中纤维素酶活性[6]。在体外产气试验中发现牛至精油能够提高饲粮养分降解率，调控瘤胃发酵，降低总产气量和甲烷产量[15]。本试验发现，饲粮中添加香芹酚可以显著提高绵羊的DMD、CPD，但对NDFD、ADFD无显著影响，这可能是因为香芹酚可以调控胃肠道中的微生物群落，提高消化酶活性，有利于促进微生物对饲粮的消化。研究发现牛至精油可以促进MCP的合成[16]，结合本试验研究结果，香芹酚显著提高CPD，而百里香酚对CPD无显著影响，可以推断出牛至精油中对蛋白质消化起主要作用的活性组分应该是香芹酚，其在促进蛋白质消化的同时加速了氮源的循环利用，有利于微生物对饲粮中蛋白质的降解利用，为动物机体提供充足的氮源，这也是CPD升高的原因之一。本研究中百里香酚对绵羊各养分表观消化率无显著影响，这也说明在本试验条件下，香芹酚更有利于促进绵羊对饲粮干物质、蛋白质的消化吸收。目前香芹酚和百里香酚单一组分在反刍动物上的研究较少，促进反刍动物养分消化的作用机理还需进一步深化研究。

3.2 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液pH及MCP、NH3-N浓度的影响

瘤胃液pH是瘤胃内环境稳态的反映指标，主要受饲粮、唾液和发酵产物的影响[16]。本研究发现，随着采食后时间的延长，瘤胃液pH先降低后升高。采食后，由于瘤胃内VFA等代谢产物的积累，pH逐渐降低，随着机体对这些代谢产物的不断吸收，pH将逐渐上升，这与本研究中瘤胃液TVFA浓度的变化规律相符。微生物利用氮源合成MCP，为反刍动物提供蛋白质来源。适宜的NH3-N浓度有利于增强瘤胃微生物活性，而NH3-N浓度过高会造成养分浪费，过低会降低瘤胃微生物活性[17]。瘤胃液NH3-N浓度降低意味着瘤胃中蛋白质降解率的降低或者瘤胃微生物对NH3-N利用率的提高。本研究发现，在瘤胃发酵过程中，香芹酚和百里香酚均可以显著提高瘤胃液MCP浓度，降低瘤胃液NH3-N浓度。但是，在发酵的不同时间内，香芹酚和百里香酚对瘤胃液MCP和NH3-N浓度的影响不同。采食后，由于食物充足，香芹酚可以促进瘤胃发酵，营养成分快速降解，瘤胃液pH迅速降低，NH3-N浓度相应升高，同时为微生物提供了充足的氮源，微生物利用大量的氮源合成MCP，因此发酵后期MCP浓度升高，NH3-N浓度逐渐降低。香芹酚和百里香酚都是牛至精油的主要活性成分，已经证实牛至精油有利于饲粮养分的降解，降低瘤胃液NH3-N浓度，促进瘤胃发酵[15]。这也表明，香芹酚和百里香酚混合使用和单独使用对瘤胃发酵都具有调控作用。

3.3 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液VFA组成的影响

饲粮中的碳水化合物通过瘤胃微生物的代谢作用，最终形成VFA，VFA是反刍动物主要的能量来源以及合成乳脂和体脂的重要原料[18]。本试验中，饲粮中添加香芹酚和百里香酚使得瘤胃液TVFA浓度升高，这主要与香芹酚和百里香酚的理化性质有关，瘤胃中VFA浓度主要受饲粮组成成分的影响[19]，但是对于组成成分相同的饲粮而言，瘤胃液中VFA浓度主要受瘤胃中微生物的种类和数量的影响，VFA是瘤胃微生物发酵的终产物，是供应反刍动物能量代谢的主要形式。本试验结果表明，香芹酚和百里香酚均可促进瘤胃发酵，可能是由于香芹酚和百里香酚可以调控瘤胃微生物，使得微生物发酵产生更多VFA，这有利于为动物生产提供更多能量，与瘤胃液中纤维素降解菌数量的变化相吻合。与此同时，瘤胃液乙酸/丙酸值在试验中无显著差异，这也表明香芹酚和百里香酚的添加只是促进了瘤胃的发酵程度，并没有改变瘤胃发酵类型，从数据来看，依然是以乙酸发酵为主。

3.4 香芹酚和百里香酚对绵羊瘤胃液纤维降解菌数量的影响

反刍动物所需营养主要来源于瘤胃微生物对饲粮中碳水化合物的发酵。香芹酚和百里香酚能加速胃肠道上皮细胞的更新率，减少病原体对肠道上皮细胞的感染，抑制有害菌的生长[20]。本研究发现，香芹酚可以提高绵羊瘤胃液黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌数量，同时降低了白色瘤胃球菌数量；百里香酚可以降低绵羊瘤胃液白色瘤胃球菌数量，对其他2种纤维降解菌数量无显著影响。黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌是瘤胃中主要的纤维降解菌[21]，纤维降解菌数量升高加速了对碳水化合物的降解利用。香芹酚和百里香酚对纤维降解菌的影响各异，这可能与自身的理化性质有关。香芹酚在显著降低瘤胃液白色瘤胃球菌数量的同时，显著升高黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌数量，这有可能是由于白色瘤胃球菌和其他2种纤维降解菌存在竞争的关系，白色瘤胃球菌数量的降低使得其他2种纤维降解菌活性增强，同时可以获取更多的氮源来合成MCP，这与前文中MCP浓度显著升高的结论相一致。另外，结合前文中养分表观消化率的结果可以推断，纤维降解菌数量的升高并不能直接导致饲粮纤维消化率的提高，影响饲粮纤维消化率的因素复杂多变，饲粮纤维消化率受动物品种和生理阶段、饲粮组成和结构、流通速度等诸多因素的影响[22]。已有研究发现，饲粮添加牛至精油可以显著增加黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌数量[23]。牛至精油主要有效成分为香芹酚和百里香酚等物质，结合本试验结果可以推断，混合植物精油对瘤胃微生物的活性作用优于单一成分的植物精油，香芹酚和百里香酚之间可能存在一定的协同效应，这可能也是有本试验结果与上述研究结果有所差异的主要原因。

4 结 论

① 香芹酚可显著提高绵羊的DMD和CPD，促进养分的消化和吸收。

② 香芹酚、百里香酚均可显著提高绵羊瘤胃液TVFA浓度，促进瘤胃发酵。

③ 香芹酚、百里香氛均可显著降低绵羊瘤胃液白色瘤胃球菌数量，香芹酚还可显著提高绵羊瘤胃液黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌数量，调控瘤胃纤维降解菌数量。