饲料中维生素K3含量对大口黑鲈消化能力、血清代谢指标、肌肉氨基酸和脂肪酸组成的影响

2022-02-20颜克涛戴宇峰华雪铭

动物营养学报 2022年1期

魏翔颜克涛戴宇峰华雪铭* 李向杭莹

(1.上海海洋大学，农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心，上海 201306；2.上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；3.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；4.王屋水库管理所，龙口 265721；5.常州市天宁区郑陆畜牧兽医站，常州 213111)

维生素K是一种脂溶性维生素，是谷氨酰羧化酶(GGCX)羧化反应的辅助因子，GGCX可以将维生素K依赖蛋白的谷氨酸残基(Glu)羧化为γ-羧基谷氨酸(Gla)[1]。维生素K促进凝血酶原(凝血因子Ⅱ)的合成，并调节其他3种凝血因子(凝血因子Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ)的合成，从而促进凝血，因此又被称为凝血维生素。骨钙素(BGP)、基质Gla蛋白(MGP)和蛋白S是存在于骨骼内的维生素K依赖蛋白，所以维生素K对于骨骼的生长发育有积极的作用[2-3]。

维生素K从结构上来看有3种形式，它们共有甲萘醌基团。维生素K1和维生素K2是脂溶性维生素，在自然中本来就存在，维生素K3是人工合成的水溶性维生素。维生素K1主要由绿色植物合成[4-5]，维生素K2主要由微生物合成[6]。维生素K2具有一系列的形式，分子的侧链上有多个重复的异戊烯基单位，因此维生素K2又被称为MK-n，其中n表示异戊烯基单位数。目前在水产饲料中最常用的是维生素K3的复合物，以亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)和亚硫酸烟酰胺甲萘醌(MNB)最为常见。已有研究证实，饲料中的维生素K3需在体内转化为一种活性物质(MK-4)后发挥作用，主要储存在肝脏中[7-8]。

目前关于维生素K在水产动物上的研究主要集中在生理功能和需求量方面。由于水体环境复杂、物种不同、生长阶段等因素不同，不同水生动物对维生素K的需求量差异很大。鱼体摄入维生素K不足会导致组织出血和凝血时间延长等[9-11]。对底鳉(Fundulusheteroclitus)的研究表明，饲料中MSB缺乏或过量容易导致脊椎异常[12]。草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[13]、异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[14]、奥尼罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)[15]、湖红点鲑(Salvelinusnamaycush)[10]、石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)[15]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[16]、中国对虾(Penaeuschinensis)[17]和斑节对虾(Penaeusmonodon)[18]对维生素K的需求量已被确定分别为1.9 mg/kg、3.73～6.72 mg/kg、5.2 mg/kg、0.5～1.0 mg/kg、10.6 mg/kg、10.42 mg/kg、185 mg/kg和30 mg/kg。而斑点叉尾(Ietaluruspunetaus)[19]、五条(Seriolaquinqueradiata)[20]和大西洋鲑(SalmosalarL.)[21]，不需要在饲料中添加维生素K就可以满足生长和生理需求。

消化和代谢是动物机体内2个非常重要的过程。消化是指将食物溶解并降解为小分子化合物或元素，使其能够顺利通过肠壁并参与生理功能。代谢是生物体不断进行物质和能量交换的过程。已有研究表明在饲料中添加适量的维生素K3可以增强建鲤(Cyprinuscarpiovar. Jian)[22]消化酶活性和提高五龙鹅[23]的养分表观消化率，但是饲料中维生素K3含量过高会引起松浦镜鲤(CyprinuscarpioL.)[24]血清尿素氮含量升高。消化及代谢的改变或影响营养物质在机体内的沉积，水产动物的肌肉氨基酸和脂肪酸作为肉质检测的重要指标，其组成不仅影响着水产动物本身的生命活动，还对人体必需氨基酸和必需脂肪酸的摄入有着很大的影响。维生素K是否对水产动物机体中氨基酸和脂肪酸的含量和组成产生影响，尚未见相关报道。

大口黑鲈(Micropterussalmoides)是一种淡水肉食性鱼类，近年来，因其生长快、耐低温、抗病性强、口感鲜美等优点在我国广受欢迎，2019年大口黑鲈的养殖总产量已达47.8万t[25]。目前虽围绕大口黑鲈营养素的需求量开展了大量的研究[26-34]，但未见有关维生素K的研究报道。已知维生素K的主要作用有促进凝血和骨骼发育，笔者前期也发现饲料中添加适量的维生素K3可以提高大口黑鲈的生长性能、血液凝血能力、钙含量和抗氧化能力[35]，但是是否会对其他生命过程造成影响还不明确。为此，本研究探究维生素K3对大口黑鲈幼鱼消化能力、血清代谢指标、肌肉氨基酸和脂肪酸组成的影响，为大口黑鲈饲料配方的优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

配制以鱼粉、豆粕、玉米蛋白粉和血粉为主要蛋白质源、鱼油和菜籽油为主要脂肪源的基础饲料(表1)。为了控制维生素K3含量，在基础饲料中添加不同水平的亚硫酸烟酰胺甲萘醌(MNB，纯度96.33%，由浙江某饲料开发有限公司提供)，同时减少沸石粉的用量，配制5种试验饲料，使得饲料中维生素K3的含量分别为0.78(K0组)、5.80(K5组)、10.82(K10组)、15.84(K15组)和20.85 mg/kg(K20组)。根据GB 5009.158—2016和GB/T 18872—2017，通过高效液相色谱法测定K0组饲料中维生素K1和维生素K3的含量分别为53.2 μg/kg和0.78 mg/kg。通过反相高效液相色谱法没有检测出K0组饲料中的维生素K2含量[36]。以上各种维生素K的含量均委托河南海瑞正检测技术有限公司检测。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

根据配方将各种原料称重后粉碎，过60目筛网，然后与鱼油、菜籽油和乌贼膏充分混匀，再加入水用制粒机制成颗粒料，在烘箱中40 ℃干燥12 h。干燥之后，将颗粒料储存在阴凉、干燥、通风良好的地方备用。

1.2 饲养管理

本试验在上海海洋大学滨海养殖基地进行，试验开始之前将水泥池和网箱进行消毒处理，每个水泥池内放置4个网箱(长×宽×高=1.8 m×0.7 m×0.8 m)。试验鱼购自浙江省湖州市，经过2周暂养适应试验条件，暂养期间使用购买的商品料进行投喂。在正式试验开始前将暂养鱼饥饿处理24 h，随机挑选600尾体质健康、规格均匀的大口黑鲈幼鱼[初均重(12.96±0.07)g]随机分成5组，每组4个重复，每个重复30尾，以重复为单位养殖于网箱。每天进行2次(08:00和16:00)表观饱食投喂，持续8周，记录每天的摄食量。当有大口黑鲈死亡，及时将鱼取出，计数并称重。在饲养期间，养殖水体24 h充气，不定期吸污、更换经过曝气的自来水，控制溶解氧浓度大于5 mg/L、氨氮含量小于0.5 mg/L、水温28～31 ℃、pH 7.5～8.5。

1.3 样品采集

养殖试验结束后，试验鱼饥饿24 h，每个重复随机选取7尾鱼，用1 mL注射器从尾静脉处取血，储存在离心管中，在4 ℃下静置24 h后在4 000 r/min转速下离心10 min获得的血清保存在-20 ℃条件下，用于血清代谢指标的分析。取出内脏团后，剥离胃和肠道，并将肠道外围的脂肪和肠道内的残余粪便清理干净，用于消化酶活性的测定。取侧线以上的肌肉冷冻干燥至恒重，粉碎并密封用于肌肉氨基酸和脂肪酸组成分析。之后，对剩余的大口黑鲈投喂含有三氧化二钇(Y2O3，0.1 mg/g)的饲料(相应减少沸石粉的用量)，每天投喂1 h后采集粪便，持续2周，用于表观消化率的测定。所有样品均在-20 ℃条件下保存。

1.4 样品分析

取胃和肠道称重，置于0.85 %生理盐水中冷冻匀浆(m/v=1∶4)，然后在4 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液在12 h内用于测定指标。血清解冻之后同样也在12 h内测定指标。采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定胃和肠道的淀粉酶、脂肪酶活性和血清代谢指标，用福林法(GB/T 23527—2009)测定胃和肠道蛋白酶活性。以上指标均通过UV-3200紫外分光光度计测定。

采用电感耦合等离子体质谱法(GB 5009.268—2016)测定粪便中Y2O3的含量：将粪便经冷冻干燥后使用微波消解法消解后，使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP，美国)测定粪便中Y2O3的含量。用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)测定粪便粗蛋白质含量，用于表观消化率和蛋白质表观消化率的计算。

采用酸水解法测定肌肉氨基酸组成：称量肌肉干物质，加6 mol/L盐酸溶液在110 ℃条件下水解24 h。水解完后，取1 mL水解液于进样瓶中在氨基酸自动分析仪(S-433D，德国)上分析。

采用氯仿-甲醇法提取肌肉总脂，甲酯化后，使用气相色谱仪(7890A，美国)联合质谱仪(5975A，美国)分析脂肪酸组，根据脂肪酸标准品的分析图谱、保留时间以及质谱分析对脂肪酸进行定性和定量分析。

1.5 计算公式

表观消化率(%)=(1-饲料中Y2O3含量/粪便中Y2O3含量)×100；粗蛋白质表观消化率(%)=[1-(粪便中粗蛋白质含量×饲料中Y2O3含量)/(饲料中粗蛋白质含量×粪便中Y2O3含量)]×100；必需氨基酸指数(EAAI)=(A/AE×B/BE×……×I/IE)(1/n)。

式中：n为必需氨基酸数量；A，B，…，I为大口黑鲈肌肉中必需氨基酸含量；AE，BE，…，IE为全鸡蛋蛋白质中必需氨基酸含量[37]。

1.6 数据统计分析

所有数据均采用SPSS 17.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行分析，以平均值±标准差(mean±SD)表示。当方差分析确定组间差异显著时，则用Duncan氏法进行多重比较，显著性水平为P<0.05。

2 结果

2.1 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈消化能力的影响

由表2可以看出，添加维生素K3的各组胃和肠道的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均显著低于未添加维生素K3的K0组(P<0.05)。K10组、K15组和K20组的表观消化率和蛋白质表观消化率显著低于K0组(P<0.05)。

表2 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈消化能力的影响Table 2 Effects of dietary vitamin K3 content on digestive ability of largemouth bass

2.2 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈血清代谢指标的影响

由表3可以看出，K20组血清尿素氮含量显著高于其他4组(P<0.05)，5组间血清总蛋白、白蛋白、总胆固醇和甘油三酯含量无显著差异(P>0.05)。

表3 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈血清代谢指标的影响Table 3 Effects of dietary vitamin K3 content on serum metabolism indexes of largemouth bass

2.3 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈肌肉氨基酸和脂肪酸组成的影响

在大口黑鲈肌肉中共检测出17种氨基酸，其中必需氨基酸9种，非必需氨基酸8种，色氨酸未检测。由表4可知，必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸含量及必需氨基酸指数在各组之间无显著差异(P>0.05)，但是随着饲料中维生素K3含量的增加，必需氨基酸和总氨基酸含量呈增加的趋势。K0组苏氨酸、异亮氨酸和亮氨酸含量显著低于其他4组(P<0.05)。

表4 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈肌肉氨基酸组成的影响(湿重基础)Table 4 Effects of dietary vitamin K3 content on amino acid composition of largemouth bass (wet weight basis) g/kg

在大口黑鲈肌肉中共检测出15种脂肪酸，其中饱和脂肪酸5种，单不饱和脂肪4种酸，多不饱和脂肪酸6种。由表5可以看出，K15组的单不饱和脂肪酸含量显著高于其他4组(P<0.05)，其中C16∶1n7和C18∶1n5的含量均显著高于其他4组(P<0.05)。饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量在各组之间无显著差异(P>0.05)。

表5 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈肌肉脂肪酸组成的影响(湿重基础) Table 5 Effects of dietary vitamin K3 content on fatty acid composition of largemouth bass (wet weight basis) mg/g

续表5项目 Items组别 GroupsK0K5K10K15K20C18∶1n51.86±0.10a1.80±0.22a1.82±0.12a2.19±0.11b1.97±0.11aC18∶1n90.03±0.000.03±0.000.02±0.000.03±0.010.03±0.00C20∶1n70.05±0.000.05±0.010.05±0.000.06±0.000.06±0.00ΣMUFA 2.28±0.13a2.23±0.27a2.23±0.15a2.72±0.14b2.46±0.13aC18∶2n61.02±0.090.97±0.120.97±0.041.00±0.031.01±0.06C18∶3n30.10±0.010.09±0.020.09±0.010.09±0.010.10±0.00C20∶4n60.03±0.000.03±0.000.02±0.000.03±0.000.02±0.01C20∶5n30.04±0.000.04±0.010.04±0.000.04±0.000.04±0.01C22∶5n60.06±0.000.05±0.000.05±0.000.05±0.000.05±0.01C22∶6n30.77±0.080.75±0.160.72±0.010.81±0.130.71±0.04ΣPUFA 2.01±0.181.93±0.291.90±0.072.02±0.121.94±0.11

3 讨论

3.1 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈消化能力的影响

饲料利用效率取决于鱼的消化和吸收能力[38]，消化能力与消化酶的活性密切相关，包括蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶[39]。已有研究表明，维生素K3能够促进畜禽肠道蠕动和分泌，进而促进动物的消化吸收[40]，但是在水产动物中鲜有此方面的报道。本试验结果表明，饲料中添加维生素K3后，大口黑鲈的消化酶活性均显著降低，表观消化率和蛋白质表观消化率也有同样的结果。但是Yuan等[22]研究发现，适量的维生素K能够显著增强建鲤肝胰脏和肠道的消化酶活性，提高前肠的胆囊收缩素含量，并且认为消化酶活性的提高可能与胆囊收缩素有关。在大西洋鲑的研究中也发现胆囊收缩素能够促进大西洋鲑胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌[41]。吕梅等[23]研究发现适量的维生素K3可以显著提高五龙鹅的表观消化率。Yuan等[22]还发现维生素K可能促进肠道的生长发育，提高肠道刷状缘酶活性，提高建鲤的吸收能力。本课题组前期研究发现添加维生素K3的试验组肠体比显著高于对照组[35]，推测维生素K3可以通过延长消化时间的方法帮助大口黑鲈吸收足够的营养；相反，对照组的肠体比显著低于试验组，可能会导致鱼体消化能力不足，需要通过其他途径，如提高消化酶的活性，使机体的营养水平满足生长发育的需求。但无论是改变肠长还是消化酶活性，添加维生素K3均降低了机体对营养物质的消化吸收率，这是否与机体的整体代谢率下降有关，还有待验证。

3.2 饲料中维生素K3含量对大口黑鲈血清代谢指标的影响

肝脏是维生素K代谢的主要部位，维生素K的羧化作用是在肝脏中完成的。饲料中维生素K的含量可能会影响肝脏的消化、合成、储存和解毒功能[24]。血清总蛋白、白蛋白和尿素氮含量是反映蛋白质代谢的重要指标，血清中总蛋白和白蛋白含量低表明水生生物营养不良，蛋白质代谢状态不佳[42-43]。动物血清中90%～95%的蛋白质在肝脏中合成，血清总蛋白含量可以作反映为动物肝脏合成蛋白质能力的一个指标，当肝功能严重受损时，蛋白质的合成效率会降低，尤其是白蛋白。仅当肝脏病变到一定程度之后，血清中的白蛋白含量才会出现显著差异[44]。在本研究中，血清总蛋白和白蛋白含量在各组间无显著差异，这一结果与王洋等[24]对松浦镜鲤的研究结果一致。氨和尿素是蛋白质代谢的终产物，大多数鱼类是排氨动物，而形成尿素不仅有助于解除氨的毒性，还可以降低体内由三羧酸循环产生的二氧化碳溶于血液所产生的酸性。本试验中，K20组血清尿素氮含量显著高于其他4组，可能是机体的一种自我保护机制，也可能是由尿素氮排泄不畅导致的。Chiou等[45]给小鼠注射高剂量的维生素K，当注射量≥25 mg/kg时，小鼠肾脏出现颗粒变性的现象。当饲料中维生素K3含量高达1 000～2 500 mg/kg，会对马的肾脏造成损伤[46]。由此推测，饲料中维生素K3含量过高可能会引起大口黑鲈肾脏受损，从而导致血清尿素氮含量增加。王洋等[24]对松浦镜鲤的研究也发现，当饲料中维生素K3含量过高时，血清尿素氮含量显著增加，是其他组含量的2～3倍。血清总胆固醇和甘油三酯是血清脂质的重要成分，两者都可以作为体内脂质代谢的指标。在本研究中，血清总胆固醇和甘油三酯含量各组间均无显著差异，说明维生素K3对血脂代谢的影响较小，具体机制有待进一步研究。

3.3 饲料中添加维生素K3对大口黑鲈肌肉氨基酸和脂肪酸组成的影响

人体必须从食物中获取赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸等8种必需氨基酸，来满足人体新陈代谢的需求[47]。在本研究中，大口黑鲈摄食添加不同水平维生素K3的饲料，肌肉苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸含量均显著增加，更能满足人体对这3种必需氨基酸的需求；与此同时，随着饲料中维生素K3含量的增加，肌肉组氨酸、精氨酸和酪氨酸含量有降低的趋势，但必需氨基酸和总氨基酸含量均有增长的趋势，说明维生素K3对肌肉氨基酸组成有一定程度的改善效果；5组之间必需氨基酸指数没有显著差异，且均大于0.95[48]，说明大口黑鲈属于优质蛋白质食物。水产动物的肌肉富含脂肪酸，是人类获取脂肪酸的重要来源。脂肪酸中的不饱和脂肪酸对人体的身体健康以及生理功能有着极为重要的作用[49]。在本研究中，投喂含有15.84 mg/kg维生素K3的饲料，可以有效促进大口黑鲈肌肉中C16∶1n7和C18∶1n5含量的提升。C16∶1n7可以帮助人体控制体重，改善皮肤状况，预防动脉粥样硬化等[50]，但是C18∶1n5可能会使心血管疾病的发病率增加[51]。C22∶6n3(DHA)具有辅助人体脑细胞发育、改善血液循环等功能，虽然其含量在各组间无显著差异，但是K15组的肌肉DHA含量高于其他组。综上所述，饲料中添加适量的维生素K3对于大口黑鲈的肌肉氨基酸组成具有积极的改善作用。笔者前期研究发现，添加维生素K3的各试验组大口黑鲈的终末体重(44.01～47.46 g)均大于对照组(43.37 g)[35]；对草鱼的研究也得出了类似的结果[52-54]。上述结果表明肌肉氨基酸组成与体重有关，也间接证明氨基酸在促进鱼体生长方面发挥着重要作用。不过，关于维生素K3对大口黑鲈氨基酸和脂肪酸组成影响的具体机制还不明确。