沈义媛 詹经纬 李 欣 牛 慧 吴富鑫 关淑文 童津津* 蒋林树* 熊本海

(1.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

牛奶作为重要的高营养动物蛋白质产品，包含了丰富的营养物质，具有预防骨质疏松、提高免疫力等功效。牛奶的产量和品质受到较多因素的影响，主要包括奶牛的遗传改良、饲养管理和饲粮组成等[1-2]。近年来，越来越多的研究发现，在相同的饲粮和管理条件下，一些奶牛有相对较高的产奶量和乳品质，这可能成为提高生产效益的新性状[3]。瘤胃作为反刍动物所特有的生物反应器，使奶牛将复杂难解的植物降解为挥发性脂肪酸(VFA)、氨基酸、葡萄糖(GLU)和甘油等乳前体物。本团队前期研究[4-5]发现，高产奶牛瘤胃内总挥发性脂肪酸(TVFA)和氨基酸含量显著高于低产奶牛，并验证了高、低产奶牛瘤胃发酵过程中瘤胃微生物的重要调节作用，从瘤胃发酵的角度解释了高、低产奶牛生产性能的显著差异，但是没有全面考虑奶牛机体的能量代谢。

近年来，血液生化指标如血清GLU、非酯化脂肪酸(NEFA)、尿素氮(UN)和胆固醇含量等已经广泛用于反映奶牛的代谢和健康状况。田超等[6]的研究表明，围产期奶牛处于能量负平衡状态时，血液中NEFA含量升高，可能会导致乳脂含量增加、乳蛋白含量降低。Maeda等[7]通过连续检测泌乳奶牛的血清生化指标，如GLU、总胆固醇(TC)、脂联素(ADN)等含量的变化，结果发现ADN可以调节瘤胃酸中毒所引起炎症反应，并改善脂多糖引起的胰岛素抵抗，并推测ADN可作为瘤胃酸中毒的评估指标。曲明姿[8]的研究发现，在热应激情况下，高产奶牛血清中极低密度脂蛋白(VLDL)、载脂蛋白B100(ApoB-100)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量显著高于低产奶牛，证明高产奶牛肝脏运输甘油三酯(TG)的能力更强。但是，对于相同饲养条件下，不同泌乳水平奶牛间瘤胃发酵参数、血清生化指标及其与泌乳性能相关性分析未见报道。

因此，本研究通过对不同泌乳水平奶牛的乳成分、瘤胃发酵及血清代谢相关指标进行综合分析，以期从机体代谢的角度进一步解释高、低产奶牛瘤胃发酵和营养利用差异的内在机制，为奶牛营养调控和科学管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

本试验采用随机区组试验设计，选择24头体况良好的荷斯坦奶牛，按产奶量分为高产组[(41.7±4.8) kg/d]和低产组[(24.1±3.9) kg/d]，各12头，本试验所用奶牛体重[(648.50±68.65) kg]、胎次[(2.64±0.70)胎]和泌乳天数[(182.0±31.5) d]均相近。每天07:00、13:00和18:00对奶牛进行投料，自由采食和饮水，早、中、晚共挤奶3次。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.2 样品采集与测定

1.2.1 奶样的采集与测定

使用牛场连接有采样器的挤奶设施采集2组奶牛的奶样，按早、中、晚为4∶3∶3的比例混合，采样前在50 mL离心管中添加防腐剂重铬酸钾，混合均匀后贮存到4 ℃冰箱中，及时送到北京市奶牛中心，用LACTOSCAN型全自动超声波乳成分分析仪进行乳成分分析，测定指标如下：乳蛋白率、乳脂率、乳糖率、乳体细胞数(somatic cell count,SCC)及乳尿素氮和总固形物含量。

1.2.2 瘤胃液的采集与测定

在晨饲前2 h，使用口腔采样器采集2组奶牛的瘤胃液，丢弃第1次抽取出的瘤胃液约100 mL，固定好口腔导管抽取第2次瘤胃液，立即使用便携式pH计测定瘤胃液pH，4层纱布过滤后分装于50 mL离心管，-20 ℃保存，于实验室测定氨态氮(NH3-N)、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和异戊酸含量。NH3-N含量采用Weatherburn[9]建立的比色法进行测定，取瘤胃液6 mL于10 mL离心管中，12 000 r/min离心20 min，取出上清液40 μL，分别加入A液(苯酚显色剂)2.5 mL、B液(次氯酸盐试剂)2.0 mL，涡旋振荡均匀，将样品放置37 ℃水浴中显色30 min。使用分光光度计，在波长550 nm处测定样品吸光度，根据标准曲线计算每个样品中NH3-N含量；VFA含量采用Qin[10]建立的毛细管柱气相色谱法测定，取5 mL瘤胃液，在10 000 r/min离心10 min，移取1.5 mL上清液至离心管中，加0.15 mL 25 %偏磷酸，用涡流混合器摇匀，静置30 min，在10 000 r/min下离心15 min，取上清液供气相色谱仪测定。色谱柱条件：DB-FFAP(15 m×0.32 mm×0.25 pm)；柱温：100 ℃，2 ℃/min至120 ℃，维持10 min；进样口温度：250 ℃；检测器温度：280 ℃；恒压：21.8 kPa；分流比：1∶50；进样量：2 μL。

1.2.3 血样的采集与测定

在晨饲前2 h，用含肝素钠抗凝的真空采血管进行尾静脉采血，采集血样10 mL,立即以3 000 r/min离心15 min得到血清，并用移液枪分装到5 mL离心管中，-20 ℃保存待测。血液样品所有测定指标均在北京华英生物技术研究所完成，其中血清白细胞介素(IL)-2、IL-6含量采用酶免法测定，其余指标均为比色法进行测定。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2007和SPSS 21.0进行处理，并进行t检验，P<0.05表示统计差异显著，P<0.01表示统计差异极显著。

2 结 果

2.1 不同泌乳水平奶牛乳成分比较

由表2可知，高产组奶牛的产奶量、4%校正乳(4%FCM)产量以及能量校正乳(ECM)产量均极显著高于低产组(P<0.01)。从乳成分来看，高产组奶牛的乳脂、乳蛋白和乳糖含量均极显著高于低产组(P<0.01)，总固形物含量显著高于低产组(P<0.05)，乳蛋白率极显著低于低产组(P<0.01)，但乳脂率、乳糖率、SCC与低产组差异不显著(P>0.05)。

表2 高、低产奶牛乳成分比较Table 2 Comparison of milk composition between high and low lactating dairy cows

2.2 不同泌乳水平奶牛瘤胃发酵参数比较

由表3可知，高产组瘤胃液TVFA、丙酸、丁酸含量极显著高于低产组(P<0.01)，乙酸含量显著高于低产组(P<0.05)，pH和氨态氮、异丁酸、戊酸和异戊酸含量与低产组差异不显著(P>0.05)。

表3 高、低产奶牛瘤胃发酵参数比较Table 3 Rumen fermentation parameters between high and low lactating dairy cows

2.3 不同泌乳水平奶牛血清能量代谢比较

由表4可知，高产组血清中β-羟丁酸(BHBA)含量极显著高于低产组(P<0.01)，NEFA含量显著高于低产组(P<0.05)，而GLU和TG含量极显著低于低产组(P<0.01)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量显著低于低产组(P<0.05)，但高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和UN含量与低产组差异不显著(P>0.05)。

表4 高、低产奶牛血清能量代谢指标比较Table 4 Comparison of serum energy metabolism indexes between high and low lactating dairy cows

2.4 不同泌乳水平奶牛血清抗氧化指标比较

由表5可知，高产组血清中丙二醛(MDA)含量显著高于低产组(P<0.05)，总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性显著低于低产组(P<0.05)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性与低产组差异不显著(P>0.05)。

表5 高、低产奶牛血清抗氧化指标比较Table 5 Comparison of serum antioxidant indexes between high and low lactating dairy cows

2.5 不同泌乳水平奶牛血清免疫性能的比较

由表6可知，高产组血清中IL-2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量极显著低于低产组(P<0.01)，免疫球蛋白G(IgG)、IL-6含量显著低于低产组(P<0.05)，而免疫球蛋白M(IgM)含量显著高于低产组(P<0.05)。

表6 高、低产奶牛血清免疫性能比较Table 6 Comparison of serum immune indexes between high and low lactating dairy cows

3 讨 论

3.1 不同泌乳水平奶牛的乳成分和瘤胃发酵参数的差异分析

奶牛的乳成分与瘤胃发酵参数的变化，不仅受到饲粮组成、饲养管理、遗传以及环境应激等因素的影响，奶牛自身的消化代谢机制也起到重要的调节作用。本研究结果表明，高产组和低产组奶牛瘤胃中TVFA、乙酸、丙酸和丁酸含量存在显著性差异。反刍动物所需的营养主要来源于饲粮中的碳水化合物、脂肪和蛋白质，营养物质在胃肠道内被分解为可吸收的物质，如VFA、氨基酸和GLU等。据报道，瘤胃在发酵的过程中可以产生的大量VFA，供给动物机体70%左右的能量[13]，而且多项研究证实，瘤胃内进行乙酸和丙酸发酵，乙酸参与了三羧酸循环，进行氧化供能或用于脂肪酸合成，丙酸是糖异生的前体物质，也是反刍动物所需GLU的主要来源。Zhao等[14]研究发现，随着奶牛饲粮中粗饲料的变化，瘤胃微生物的区系结构也发生显著的变化，进而影响瘤胃微生物的代谢，改变微生物蛋白和VFA的产量。Tong等[5]研究发现，不同泌乳水平奶牛的瘤胃微生物区系和瘤胃代谢产物之间存在显著差异，这对调节乳合成前体物的生成具有重要的影响。由此可见，高产奶牛可以利用饲粮促进合成更多的乳合成前体物，如VFA作为反刍动物的能量来源、微生物蛋白作为反刍动物氨基酸代谢和乳蛋白合成氨基酸的来源，这是导致奶牛不同产奶量的主要因素之一[15]。因此，瘤胃发酵对奶牛的生产性能及宿主健康等的影响具有重要的作用，而能够靶向调节瘤胃发酵模式的技术手段更值得深入的研究。

乳腺中将近1/2的脂肪酸来自乙酸、BHBA等前体物质的合成，其他则从血液中吸收而来。乳脂合成是乳脂前体物在相关脂肪合成酶的作用下完成的。据报道，奶牛乳汁中的脂肪酸合成主要通过2条通路：1)乳腺从头合成，饲粮在瘤胃中经微生物发酵产生VFA，大部分被瘤胃壁吸收进入血液，此时丁酸合成BHBA，乙酸转化为乙酰辅酶A，经血液运输到乳腺组织中；2)从血液中获取长链脂肪酸，饲粮中的脂肪被瘤胃微生物脂肪酶水解，继而发生生物氢化，脂肪酸以NEFA的形式经血液循环到达乳腺合成乳脂。本研究结果发现，高产奶牛的乳脂产量显著高于低产组。Sofyan等[16]的研究表明，高产组奶牛胆固醇、BHBA含量显著高于低产组，且高产组奶牛瘤胃内丁酸含量与血清中BHBA含量呈显著正相关关系。与之相一致，本研究的结果显示高产组奶牛瘤胃液中乙酸、丁酸的含量以及血清中BHBA含量均显著高于低产组，证实了乳脂产量与瘤胃发酵、血液调节脂肪酸合成的相关性。由此可见，高、低产奶牛在瘤胃发酵合成乳前体物的差异可作为高效靶点，对瘤胃发酵进行有效地调控，可以更好地发挥动物的生产性能，维持动物健康。

TG、LDL-C、HDL-C是血脂的重要组成部分[17]，脂质动员产生的NEFA在肝脏中被酯化为TG，以VLDL的形式入血，在本研究中，高产奶牛血清中NEFA、TG含量显著低于低产组，提示高产奶牛脂质动员程度可能低于低产奶牛，这与张辉等[18]、武雪会等[19]的研究相反。LDL-C是一种用来反映低密度脂蛋白(LDL)水平的指标，LDL是由VLDL转变而来的，可以在肝脏中结合胆固醇并将其运输到全身各处细胞。本研究中高产奶牛血清LDL-C含量显著低于低产组，这可能是因为高产组血清TG含量显著降低导致VLDL形式入血减少，进而导致LDL-C含量降低。

先前的研究表明，丙酸提供了奶牛体内近50%的GLU，肝脏利用丙酸生产的GLU大多数被合成乳糖[20]。本试验结果表明，高产组奶牛的乳糖含量显著高于低产组，瘤胃液丙酸含量极显著高于低产奶牛，这与Sofyan等[16]的研究结果一致，即高产奶牛能产生更多的乳糖前体物质丙酸，从而为乳糖的合成提供了充足的保障。然而，高产奶牛血清GLU含量显著低于低产奶牛，这可能是因为奶牛机体首先利用血糖为泌乳供能，而高产牛需要更多的能量维持泌乳，从而导致高产组奶牛血清中的GLU含量较低。UN和NH3-N是评价奶牛蛋白质代谢状态的重要指标，在本试验中，NH3-N和UN含量都没有显著差异，但是瘤胃内NH3-N含量在高产奶牛中较高，血清UN含量在高产奶牛中较低，提示高产奶牛有较高的蛋白质降解能力的同时，可以更好地利用NH3-N合成微生物蛋白，而低产奶牛则是通过肝脏将过量的氨转变为尿素进入到血液[19]，这在一定程度上解释了高产组奶牛乳蛋白含量显著高于低产组的原因。其中，值得注意的是，高产组奶牛的乳蛋白率显著低于低产组奶牛，与牛慧等[21]、Nasr等[22]的研究相一致，这可能是牛奶的稀释效应所引起的。

3.2 不同泌乳水平奶牛血清抗氧化和免疫指标的差异分析

奶牛的日常代谢活动会产生大量的自由基和其他生物活性物质，此时，机体内的抗氧化系统可以清除过量的自由基以维持机体的平衡状态。在应激条件下，抗氧化酶(如CAT、SOD、GSH-Px)的活性降低，机体的防御系统无法及时清除大量自由基继而引起炎症反应。因此，反刍动物血清中MDA含量和抗氧化酶活性通常用作确定氧化和应激程度的生理指标[23]。其中，SOD是动物体内的金属性抗氧化酶，在GSH-Px共同作用下清除体内氧化物质，SOD活性降低，表明机体抗氧化能力下降；MDA是动物机体内脂质过氧化反应的终产物，MDA含量越低，表明动物机体抗氧化能力越强[24]。Löhrke等[25]的研究表明，与低产奶牛相比，高产奶牛血液中脂质过氧化物的含量明显升髙。与前人结果一致，在本试验中，高产奶牛血清中MDA含量显著高于低产组，且抗氧化酶T-AOC、SOD活性显著低于低产组，证明高产奶牛清除自由基、抗氧化能力较弱。此外，有研究表明，奶牛NEFA和BHBA的大量动员与自由基产生的增加有关，并促进了MDA含量的增加[26]，但在本试验中没有体现。

抗体是先天免疫系统的重要组成部分，可作为机体的第1道防线来抵抗感染。其中，IgM和IgG是最重要的2类免疫球蛋白[27]。有研究表明，IgM的抗氧化应激能力比IgG更强[28]，此外，Reyneveld等[29]的报道指出，高水平的IgM可以抗氧化低密度脂蛋白(LDL)，而高水平的IgG会结合LDL，这可能促进动脉粥样硬化。在本试验中，高产奶牛血清中IgM含量显著高于低产奶牛，IgG含量显著低于低产奶牛，这提示高产奶牛需要通过更强的免疫反应中和体内的氧化应激。研究表明，促炎因子可以促进免疫细胞的增殖并增强其功能活性，起到抵抗疾病，调节机体免疫力的作用。在本试验中，高产奶牛血清中的促炎因子IL-2、IL-6、TNF-α含量显著低于低产奶牛，表明高产奶牛的免疫性能较低，这与张辉等[18]的研究一致，即随着产奶量的升高，奶牛的抵抗力下降。综上所述，高、低产奶牛之间的免疫力和抗应激能力存在显著性差异，此外证明高产奶牛比低产奶牛承担了更多的应激压力。

4 结 论

在相同的饲养和管理条件下，不同泌乳水平奶牛的瘤胃发酵能力存在显著差异，高产奶牛比低产奶牛的瘤胃发酵能力更强，可以产生更多的乳前体物质。此外，不同泌乳水平奶牛血清代谢指标的差异表明，高产奶牛能够更加有效地利用这些前体物质合成乳内容物，因此，高产奶牛乳中的乳脂、乳糖、乳蛋白及乳总固形物含量显著高于低产奶牛。与此同时，由于代谢旺盛，高产奶牛的免疫性能和抗氧化能力较低。因此，为提高奶牛的产奶量，不仅要对瘤胃发酵进行有效调控，还应该改善高产奶牛的抗应激能力。