杨迷芳，江宏兵，潘永初，王 林

（1.江苏省口腔疾病研究重点实验室，江苏 南京 210029；2.南京医科大学附属口腔医院，江苏 南京 210029）

江苏省口腔疾病研究重点实验室成立于2004年，是江苏省内首家具有较大规模、较高档次、开展项目较全的口腔医学研究公共实验平台，隶属于南京医科大学和江苏省口腔医院，是院校共建的公共实验平台。实验室自成立以来，本着资源共享、优化配置和集约化管理的原则，充分整合空间资源、仪器设备资源和管理队伍资源，避免了仪器设备的重复购置，提高了实验资源的利用率，以最小的投入获取最大的利益，集约化管理是我们实验平台实现高速发展的保障[1-2]。经过17年的发展，本公共实验平台的细胞培养室总面积接近200平方米，拥有20台生物安全柜，25台细胞培养箱，可以同时为20名师生的细胞培养提供场地和配套仪器设备。平均每天有约150名师生利用该室进行与细胞培养有关的科研工作。集约化的管理带给我们高速发展和便利化管理的同时，细胞污染也成为本平台细胞培养室最大的威胁，细胞污染一旦蔓延开来，势必造成更大的不可挽回的损失，需要投入更多的时间，更大的人力、物力进行治理。因此预防和避免细胞污染是成为本平台细胞培养室管理的第一要务。我们作为如此大型的公共细胞培养室的管理者，总结了多年的管理经验，从细胞培养室的建设布局、制度管理、仪器管理、人员管理及操作管理的角度，分析公共实验平台的细胞培养室特有的污染风险因素以及控制策略，希望为该类实验室管理工作提供参考，促进该类实验室管理工作更好的发展。

1 细胞培养室选址和布局

在本公共实验平台建设过程中，细胞培养室从早期的20平方米经历多次扩建，才慢慢发展到如今的200平方米。由于建设时间跨度大，细胞培养室的整个建设过程缺少统一的规划设计，而且细胞培养室的场地是由20世纪50年代的办公场地改建而来，房屋本身承重有限，无法安装洁净设备，目前仅有紫外灭菌灯和空气消毒机，无法保证细胞培养室内环境的洁净要求。另外，由于房屋结构无法改变，细胞培养室布局结构并不合理，导致无菌操作设备、孵育设备和样本制备等设备混放在一起，实验人员在使用过程中，常常在各实验设备中来回穿插，造成相互之间交叉干扰。这些选址和布局方面造成的影响，从根本上增加了细胞培养室的管理难度。

在医院的十四五发展规划中，细胞培养室的建设是实验室发展规划的重点项目之一，在新的建设规划中，我们将选址、房屋结构作为重点因素，从规划设计上，彻底改变细胞培养室管理的潜在风险。在新的细胞培养室的设计规划中，我们将细胞培养实验室分为无菌操作区、孵育区、制备区、储藏区、清洗和消毒灭菌区六部分。同时，这些区域的共同要求是房间要宽敞明亮，地面要便于清洁、防滑，墙壁的质地光滑坚硬，仪器设备布局合理、方便操作。细胞培养室还规划有独立的空气洁净系统，以保证细胞培养室的温度、湿度和洁净度。细胞培养室各区合理布局，面积大小适中，要求同时在细胞培养间操作的人数不能超过4人，从根本上降低细胞培养室环境污染的风险[3-4]。

2 细胞培养室管理办法

近年来，随着本平台细胞培养室规模不断扩大，使用人数也不断攀升，使用人员日趋复杂，在细胞培养过程中出现的问题也逐渐多样化。而早期制定的细胞培养室管理办法，大多从网上照搬过来，这些条例内容大多相似，而且仅强调无菌操作区规范，忽略了人员进出、物品进出、物品摆放、培养箱的使用、实验垃圾的处理等各个环节的规章制度建设，造成管理制度与实际管理脱节，无法保证细胞培养室的有序进行。

图1 细胞培养室布局示意图

针对以上问题，我们在管理过程中，我们收集了在管理中，经常出现的问题，并深入分析问题的本质，进而细化出相应的规章制度，从而制定出了针对性强、涵盖面广、流程化、可操作的管理办法，从根源上减少导致细胞污染事件的发生。我们分别制定了《细胞培养室人员进出制度》《细胞培养室物品进出和摆放制度》《细胞培养实验操作步骤》《细胞培养室废弃物处理制度》《细胞培养室仪器设备使用和维护管理制度》《细胞培养室突发应急事件管理条例》《细胞培养室违规行为处罚条例》等针对细胞培养过程全流程的管理办法，并将重要的注意事项制作成展板或卡片张贴在醒目位置，提醒实验人员规范操作。细胞培养室的管理从粗放到逐步完善的精细化管理，增强了研究生的规范意识，减少了细胞培养室污染的潜在风险[5-7]。

3 培训与考核

本平台细胞培养室作为公共实验平台，对本院所有学科的师生开放，同时还接收兄弟院校师生的申请。目前，每年使用培养室登记在册约150人，其中80%为硕士研究生，他们来自不同的专业和年级，其中90%学生在进入实验室之前，对细胞培养室规章制度缺乏了解，对细胞培养技术知之甚少，对操作技术的掌握几乎为零。本平台细胞培养室在管理初期，仅针对初入细胞培养室的学生进行规章制度以及具体的实验操作进行系统培训，通过培训考核后即可进入细胞培养室操作。由于训练的时间较短，很多初入实验室的学生对细胞培养技术掌握并不牢固，往往会跟着课题组内的师兄、师姐继续练习。而部分师兄、师姐由于长时间的操作后，对细胞培养室的规章制度、操作流程往往持麻木态度，逐渐出现懈怠思想，在操作细节上逐渐出现问题，比如：进出细胞房不穿鞋套、实验操作时不戴手套、实验前后不消毒安全柜台面等。这种高年级学生带低年级学生的“帮、传、带”传授方法，往往存在错误示范，循环往复之下，实验室的污染风险更加严重。而且，这种由于操作行为引起的污染，往往会造成整个培养室环境的污染，却难以寻找污染的源头。因此，在细胞培养室管理制度中，增加系统的规章制度培训和细胞培养技术操作培训的频次，并且加强现场巡查指导和纠错机制必不可少[8]。

针对此情况，本平台细胞培养室，制定了以下培训和考核制度。培训方式包括PPT学习和现场操作培训。我们将细胞培养室培训内容制作成PPT课件供申请者网上学习，并根据PPT培训内容建立考试题库。PPT培训内容包括细胞培养室人员进出、物品进出、实验操作步骤、仪器设备使用维护管理、物品存储管理、实验突发情况管理、违规处罚等全流程的规章制度，以及仪器设备使用方法和细胞培养操作步骤。现场操作部分由管理老师现场带教，实验人员现场实操，直到学会独立操作为止。本平台每月组织一次考核，线上题库和现场操作考核全部通过后，方可进入细胞培养室开展实验。题库考核和现场实操考核结果不合格者，必须重新进行培训，并再一次进行考核，直到完全通过考试。另外，管理老师每天巡查细胞培养室内学生现场操作，发现违规行为及时纠错，并将违规行为记录在册，建立违规操作名册，按照处罚条例进行处理，违规积累超过三次者，将重新参加培训和考核。通过以上培训、考核和现场巡查制度，促使师生养成规范操作的习惯，极大地减少了污染率（见图2，P52）。

图2 人员培训流程图

4 仪器设备检验维护

本平台细胞培养室共分为三个小型细胞培养室，每个细胞培养室内平均配备8台细胞培养箱、7台生物安全柜、2显微镜、2台离心机、1台细胞计数仪、4台冰箱、2台涡旋仪等，每个细胞培养室约50人使用。细胞培养箱按照课题组进行分组，每层固定人员使用，生物安全柜按照时段预约排队使用。据统计，细胞培养箱每小时至少有1次开关记录，生物安全柜每天至少8人次预约使用，冰箱、显微镜、离心机、细胞计数仪等设备开关次数更是不计其数，这些仪器设备在使用过程中，如此高频次的与不同细胞系和不同操作者接触，逐渐成了细胞培养室内潜在的污染因素的“温床”。在管理初期，细胞培养室内仪器设备由于缺乏全面性管理手段，常常由学生自己负责对设备进行维护管理，仪器设备消杀检验和维护更新更是不及时，一旦发生污染，将会引起快速蔓延。

针对此情况，我们广泛收集细胞培养室仪器管理方法的技术资料，认真学习，结合本室的实际情况整理汇总，制定出详细的细胞培养室内仪器设备管理办法[9-10]。例如：细胞培养箱箱体和附件每月用75%酒精喷洒内腔清洁消毒，每六个月进行一次箱内的高温灭菌；培养箱内增湿水盘每周使用75%酒精喷洒消毒一次，并更换水盘内的蒸馏水，同时按比例添加抑菌剂；开关培养箱取用细胞时，先用75%酒精消毒双手，再打开培养箱的门，取出的细胞培养皿或细胞培养箱先用75%酒精喷洒表面，再进行下一步操作；使用显微镜时，先用酒精喷洒载物台，再将细胞放到载物台上进行观察；显微镜的镜头每周使用吸耳球清洁一次，注意不要用水擦试镜头，避免镜头表面残留水迹，可能滋生霉菌，损坏显微镜并引起污染；使用生物安全柜前后，均需使用75%酒精擦拭清洁表面，避免交叉污染；每半年清洁一次生物安全柜的底部和内腔表面，清除底部和内腔表面的抛洒物；定期更换生物安全柜内的紫外消毒灯；冰箱门表面、离心机内腔、细胞计数仪、涡旋仪等设备，每天使用75%酒精进行两次表面消毒。通过这些仪器设备维护举措，有效降低了仪器设备带来的污染隐患[11]。

5 污染事件上报处理

目前，本平台细胞培养实验中常用的培养器皿有培养瓶、圆底细胞培养皿和方底细胞培养板，不管是哪种培养器皿，由于其体积较小，边缘光滑，在从细胞培养箱中拿取时，稍不注意，都会有打翻或滑落的情况发生。加上本实验室培养箱资源紧张，每个培养箱中的培养器皿都是多层叠放，在拿取时，更是经常发生打翻的情况。培养器皿一旦打翻或滑落，就会造成细胞和培养液的抛洒，抛撒的细胞和培养液会污染细胞培养箱的层板、水盘和其他学生的细胞样本。在早期实验室管理制度中，由于缺乏明确的污染事件上报流程和处理机制，导致学生不主动上报，管理老师对污染事件不知情，不能对污染事件作出分析和评估，更没有及时的处理措施。此时，沾染有抛洒液体的培养箱搁架、水盘和已经污染的细胞就会成为新的污染源，导致污染扩散，给更多的师生的实验研究造成难以估量的损失。

针对上述情况，本平台细胞培养室制定了严格的污染上报流程和处理措施。首先管理老师制作了《污染事件上报调查表》，表格中内容包含污染发生日期、使用细胞培养箱位置、污染事件描述、细胞类型、污染时细胞形态变化，课题组内实验物品共用情况等，本调查表每周下发给学生，并要求所有使用细胞培养室人员参与调查。除定期调查污染事件以外，学生在实验过程中如有紧急污染事件发生，也可随时填写本表，进行上报。管理老师根据每周上报的情况，分析细胞污染原因，针对性作出处理方案，处理方案执行结束后进行回访，形成一个闭环管理。通过以上上报机制和处理机制，大大提高了细胞污染事件的处理效率，有效避免了大规模污染事件的发生。

图3 污染事件处理流程图

6 结语

本公共实验平台自成立以来，在南京医科大学和江苏省口腔医院的大力支持下，不断地加强建设，引进了很多先进实验设备，硬件设施处于全省前列，本平台为院校科研事业的高速发展作出了巨大的贡献。但是，本公共实验平台的管理模式，相对于世界其他发达国家还比较落后，还存在很多问题有待解决，为了缩短落后距离，跟上时代步伐，我们的管理模式必须进行探索和改革[12]。细胞培养室作为本公共实验平台中至关重要的一部分，更应发挥其管理模式的先锋作用。我们作为一线的细胞培养室的主要管理者，应始终坚持以问题为导向，主动深入分析和思考，勇于改革创新，探索出一条有自己特色的管理模式，为院校的科研事业提供坚实的保障。