马启明，曹晨曦，陈绍锋，谢昀

1.福建医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，福州 350108；2.福建医科大学附属第一医院骨科，福州 350005

上世纪七十年代，我国创用游离皮瓣获得成功，成为显微外科发展史上的重要里程碑[1]。随着显微外科技术的进步，血管吻合通畅率达92.7%[2]，血管组织移植已成为重建手术的常规方法。但是，与血管痉挛和血栓形成相关的移植物坏死在很大程度上超出了技术控制范围，其发生率占所有显微手术的5%～10%[3]。对于重建手术后血管痉挛的定义为由病理刺激引起的血管平滑肌局部而持续性的痉挛，这与全身性的血管痉挛完全不同，后者大多是由中枢神经系统调节通路引起，是一种广泛的血管痉挛，而重建手术后的血管痉挛受中枢影响极小，几乎是局部血管痉挛[4,5]。造成血管痉挛的机制极其复杂，可由众多因素诱发，包括直接操纵血管、血管代谢失衡和内环境改变。对于显微外科医师而言，术中血管痉挛很常见，尤其是对微小血管进行操作时，更易诱发机械性血管痉挛，因此对血管痉挛的深入研究意义重大[6]。在临床条件下研究血管痉挛难度较大，可能给患者带来损伤。多数学者选择动物模型进行相关研究。现有的血管痉挛模型中，如肾上腺素诱发模型[7]、内皮素诱发模型和氯化钾诱发模型[8]，此类模型均为化学物质诱导模型，其具有较高的建模成功率及稳定性，但不能完全模拟重建手术中的血管痉挛。Hýža等[9]创建机械牵拉血管模型，使用缝线一端连接皮瓣血管蒂部，另一端由砝码提供牵拉力，以此诱发机械性血管痉挛，但其模型不能保证受牵拉的目标血管受力均匀，造成模型的不稳定以及血管痉挛程度不一。此外，由于动脉和静脉被牵拉后，二者血管生理状态表现不同步，而动脉灌注对血管组织移植影响较静脉大[10]。故本研究仅对动脉痉挛进行观测。本文目的是建立一个机械性牵拉诱发的动脉痉挛模型，以模拟重建手术中操作刺激诱发的动脉痉挛。后续将在此模型上进行解除痉挛药物的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

使用48只Sprague-Dawley成年雄性大鼠，体重（300±25）g。实验动物来源于福建医科大学动物中心，该实验得到福建医科大学实验伦理委员会批准，并在标准条件下进行（温度25℃；合适光照；无菌操作），实验中使用的药物由福建医科大学提供。

1.2 实验方法

1.2.1 解剖血管 使用2%戊巴比妥麻醉大鼠，剂量为40 mg/kg，腹股沟部备皮，消毒铺巾，由大腿膝关节内侧向腹股沟部小心快速地切开表层皮肤，暴露大鼠股动、静脉。在显微镜下游离股动静鞘长度1 cm，从游离段下方两端穿过4-0手术缝线（图1A）。目标血管两端的缝线均与肌张力换能器相连，该装置可以调整血管两端所受的拉力大小（图1B）。在解剖血管鞘过程中，不可牵拉和挤压血管，以防诱发严重的血管痉挛。所有手术操作由同一位实验人员完成。

图1 实验操作流程图A：在血管下方两端穿过手术缝线，调整手术缝线致其力的方向与血管轴向平行，该线仅套住血管但不打结 B：线两端分别通过定向滑轮（红色箭头）与肌张力换能器（黄色箭头）连接，肌张力换能器连接生物信号采集系统，可在计算机上实时显示拉力大小Fig.1 Flow chart of experimental operationA:Surgical suture lines were used at both ends of the vessel.Adjusted the direction of the sutures to be parallel to the axial direction of the blood vessel;B:The line only trapped the blood vessels but did not tie.The two ends of the line were connected to the tension transducer through a directional pulley.The muscle tension transducer was connected to the biological signal acquisition system,which could display the tension size on the computer in real time,yellow arrow referred to muscletension transducer,red arrow referred to pulley

1.2.2 分组与建模 将解剖好的大鼠放在激光散斑血流成像仪（laser speckle contrast imaging，LSCI）的操作平台上，使大鼠的股动静脉清晰暴露在视野正中部。由于解剖操作可能诱发痉挛，所以把解剖后的大鼠静置在操作台上，使其恢复生理状态的血管灌注。30 min后，记录股动脉灌注值，作为基础灌注值。在1～5组进行如下操作：使用肌张力换能器分别施加拉力5、10、15、20、25 g（表1），5 min后撤销拉力并记录股动脉灌注值作为痉挛值。在LSCI平台上实时监测股动脉灌注。把拉力撤销时间记为0（min），实验的每个步骤按照设定的时间进行（表2）。第6组进行重建手术，使用显微镊子钝性剥离目标区域的股动脉鞘。

表1 实验分组及刺激方式Tab.1 Experimental grouping and stimulation

表2 实验步骤设计及定义Tab.2 Design and definition of experimental procedure

1.2.3 激光散斑血流成像仪实时监测 调整LSCI至显像清晰。设置LSCI自动拍照功能，每10 s拍照保存，通过其内置系统，实时监测血管的平均血流灌注（ROI）。对特定大小的目标血管进行区域选定，并测量选定区域ROI值。所有组别选定区域的大小一致（图2）。

图2 血流灌注监测示意图LSCI仅测量选定区域内平均灌注量（ROI），各组别ROI测量区域大小一致Fig.2 Aschematic of theperfusionLSCI only measured the average perfusion volume(ROI)in the selected area,and the ROI measurement area of each group was consistent

1.2.3 数据采集 Hýža等[11]对血管痉挛参数的设定被广泛认同。因此，参考其研究对数据进行如下设定（图3）：（1）痉挛临界值＝痉挛后的灌注值+10%（基础灌注值－痉挛时灌注值），血流灌注在痉挛临界值以下被认为处于血管痉挛状态，而血流灌注恢复到痉挛临界值时则被认为血管痉挛已经解除，所需时间记录为T1；（2）血管痉挛后恢复到基础灌注L2时，即超灌注状态，所需时间记录为T2。

图3 血管痉挛参数设定图T1为痉挛持续时间T2为超灌注所需时间L0为痉挛后的灌注L1为痉挛临界值，其为痉挛状态解除标志L2为基础灌注值，其为超灌注状态标志Fig.3 Vasospasm parameter mappingParameters of vasospasm were set:T1 was the duration of spasm;T2 was the time required for overperfusion;L0 was perfusion after convulsion;L1 was the critical value of spasm,which was the relief indicator of spasticity;L2 was the baseline perfusion value,which wasthehyperperfusion status indicator

1.3 统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析。对各组血管痉挛持续时间和超灌注时间进行描述性统计分析，结果以（Mean±SEM）表示。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验两类时间参数组间差异，LSD检验进行组间两两比较，P＜0.05认为具有统计学意义。使用Graphpad Prism 5.0软件对各组血管灌注与时间进行做图分析，以时间为横坐标、血流灌注为纵坐标构建XY二维图。

2 结果

各组大鼠的持续痉挛时间、超灌注时间及动脉痉挛强度等见表3。在双轴力25 g组中有6只大鼠动脉痉挛后无法恢复，可能因拉力过大，导致血管解剖结构的变化，如内皮或其它结构发生断裂，仅有两只大鼠缓慢恢复灌注，排除对该组的统计分析。其余4组牵拉组（拉力5、10、15、20 g）进一步与对照组进行统计学比较。

表3 不同刺激组别分类及血管痉挛强度评估Tab.3 Classification of different stimulusgroupsand evaluation of vasospasm intensity

牵拉组（5、10、15和20 g）与对照组的痉挛持续时间、超灌注时间和过度超灌注时间进行比较（表4）：（1）就痉挛持续时间而言，牵拉5 g和10 g组与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.001）；牵拉15 g组与对照组比较差异无统计学意义（P=0.801）；而牵拉20 g组与血管剥离组相比差异有统计学意义（P＝0.041）；牵拉15 g组分别与牵拉10 g组和牵拉20 g组比较差异有统计学意义（P＜0.001；P=0.025）。（2）就达到超灌注时间而言，牵拉5 g和10 g组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.001）；牵拉15 g组与对照组比较差异无统计学意义（P=0.629）；牵拉20 g组与对照组比较差异无统计学意义（P=0.081）；牵拉15 g组与牵拉20 g组相比差异无统计学意义（P=0.199）；其余组间比较差异有统计学意义（P＜0.001）。

表4 单因素方差分析检测各组的痉挛持续时间、超灌注时间Tab.4 The spasm duration and hyperperfusion time of each group were analyzed by single factor analysis of variance

3 讨论

重建手术在显微外科中扮演重要角色，如断肢再植[12]、游离皮瓣移植[13]和肿瘤切除术后缺损部位相关性移植[14]等，此类操作大多涉及血管吻合。经过数十年的发展，显微技术取得了长足的进步，但血管吻合后的血运重建仍是移植物存活的关键因素。重建术后，血管痉挛的出现将导致移植组织的血流量减少，血液局部淤滞或血栓形成，最终可能发生大面积的移植物坏死。血管痉挛由众多因素诱发，包括直接操纵血管、血管代谢失衡和内环境改变，目前尚不清楚其具体机制[15]。因此解除血管痉挛成为手术过程中至关重要的因素。基础研究与临床密不可分，高度模拟重建手术的血管痉挛模型的建立，可为解决临床问题带来新的思路。

目前可供研究的血管痉挛模型大致分为两类，即神经源性血管痉挛模型[16]和肌源性血管痉挛模型[17]。神经源性血管痉挛模型包括去甲肾上腺素、5-羟色胺、内皮素和氯化钾溶液等局部应用诱发痉挛[18]。而肌源性血管痉挛模型包括血管剥离和机械单轴力牵拉[11]诱发的痉挛。诸如此类的模型均有其自身局限性。如该4种神经源性血管痉挛模型，仅模拟了移植术后的生理性血管活性物质的改变，未涉及手术操作对血管痉挛的影响。血管剥离能很好地模拟重建手术诱发的血管痉挛，但由于血管剥离操作人为干扰较大，受显微技术等原因影响，导致无法定量，所以剥离模型并不适合作为血管痉挛模型进行研究。机械单轴力牵拉诱发的血管痉挛模型可以定量[11]，研究者使用缝线一端牵拉皮瓣蒂部血管，一端连接相应重量的砝码造成痉挛模型，但血管吻合口是受到断口两端的轴向力，即双轴力，因此也不可完全模拟临床重建操作。本研究把血管剥离作为对照组，血管双向机械牵拉力为实验组，力求建立能高度拟合临床的定量血管痉挛模型。此外采用LSCI监测目标血管灌注，有以下优点：（1）监测探头放置在目标血管上方，避免直接接触血管；（2）无需手术分离血管束即可同时监测动脉和静脉，避免了操纵性痉挛；（3）可以实时、精确和连续地监测目标血管平均灌注。LCSI的采用使研究获得更高的数据采集质量。

本研究致力于设计一个既可定量亦可高度模拟重建术后的血管痉挛模型。使用肌张力换能器作为双轴力的牵拉装置，缝牵拉线绑在目标血管两端；通过调节螺旋按钮来调节牵拉力的大小，使目标血管受到均匀的双轴向牵拉而诱发血管痉挛。研究显示，双轴向牵拉力与血管痉挛程度关系密切（表3）。牵拉5 g和10 g组由于其力量较小，其血管痉挛持续时间与血管剥离组相比差异有统计学意义（P＜0.001）；此二组达到超灌注的时间也远远小于血管剥离组（P＜0.001），由此说明牵拉5 g和10 g组诱发的血管痉挛程度不足，难以模拟重建手术中的血管痉挛。最大牵拉力25 g组在实验中致使血管无法恢复血流灌注，可能是由于牵拉力过大，导致血管的解剖结构发生变化从而血流灌注难以恢复。本研究组认为牵拉力25 g超过血管痉挛范畴，不适合后续研究。牵拉15 g组和牵拉20 g组较为相似，二组在超灌注时间比较中无明显差异（P=0.199），但在血管痉挛持续时间比较中，前者痉挛程度明显低于后者（P=0.025）。此二组分别与对照组比较发现：牵拉15 g组在痉挛持续时间和超灌注时间与对照组无明显差异（P=0.801；P=0.629），说明双轴力牵拉15 g诱发的血管痉挛与重建手术中的血管剥离具有高度相似性，前者可以模拟临床操作诱发的血管痉挛；牵拉20 g组与对照组比较，痉挛持续时间差异有统计学意义（P=0.014），但超灌注时间比较无统计学差异（P=0.081），说明20 g组与临床操作所诱发的血管痉挛有部分相似性，但不足以模拟临床血管痉挛。本研究结果与Hýža[9]相似，其通过创建机械性牵拉皮瓣蒂血管痉挛模型发现，单轴向拉力15 g能较好地模拟皮瓣术后的血管痉挛，但其使用激光多普勒血流仪监测血流灌注量，仅能监测部分皮瓣血流量，不能监测目标血管灌注，此为研究的局限性。本研究使用无创的监测工具LSCI，能实时反映血管的痉挛情况和动态高精度地观察血管灌注，但LSCI作为一种激光检测工具，对实验环境要求较高，易受噪音和光照影响。

综上所述，双轴力牵拉15 g组在血管痉挛持续时间和超灌注时间与血管剥离诱发的血管痉挛无明显差异，可以高度模拟临床操作中的动脉痉挛。本研究建立的机械性双轴牵拉力15 g血管痉挛模型可以作为一种新的血管痉挛模型，并可在此模型上进行解痉药物的筛选或开发。