罗燕群，朱秀兰，黄 莉，黄翠玉，孙 力，张曦倩，刘风华

(广东省妇幼保健院生殖医学中心，广州 511400)

不明原因性反复种植失败(RIF)给不孕不育患者带来巨大经济和心理压力，成为辅助生殖技术中一个亟待解决的难点和热点问题。导致不明原因性RIF的机制复杂[1]，除采用植入前遗传学筛查排除非整倍体胚胎移植外，提高子宫内膜容受性成为其治疗的重要措施之一[2]。近年来，有研究发现，宫腔灌注粒细胞刺激因子(G-CSF)可增加子宫内膜厚度，提高临床妊娠率，但其在RIF患者中的应用效果尚存在争议。目前，大部分研究集中于移植前宫腔灌注G-CSF 1次对RIF效果的分析，而对宫腔灌注时机及次数的不同是否影响其疗效的研究尚少。本研究探讨了G-CSF宫腔灌注不同次数对不明原因性2次及以上RIF患者临床妊娠率、早期流产率等的影响，希望能为临床工作提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年9月至2020年4月在本院行冻融胚胎移植治疗的369个RIF周期资料。根据患者接受150 μg G-CSF宫腔灌注次数不同分为A组(宫腔灌注0次，278例)、B组(宫腔灌注1次，51例)和C组(宫腔灌注2次，40例)。本研究已通过本院伦理委员会审核批准(201801088号)。纳入标准：(1)移植年龄小于40岁；(2)既往至少2次或以上移植周期(包括新鲜或冻融胚胎)，每个周期移植至少1个优质胚胎[3]，累积移植大于或等于4个优质胚胎[4-5]；(3)基础卵泡刺激素(FSH)<15 U/L；(4)均为冻融囊胚移植；(5)签署本研究知情同意书。排除标准：(1)男女双方染色体核型异常；(2)自然周期排卵日或激素替代疗法(HRT)内膜转化日子宫内膜厚度小于7 mm[6]；(3)女方抗磷脂抗体阳性；(4)D-二聚体、凝血酶Ⅲ异常；(5)输卵管积水；(6)子宫畸形；(7)中、重度子宫粘连电切术后。

1.2 方法

1.2.1宫腔灌注时间

(1)B组：自然周期卵泡破裂日或激素替代人工周期内膜转化日。(2)C组：第1次在自然周期卵泡晚期或行激素替代人工周期雌激素补充第12天左右；第2次在自然周期卵泡破裂日或行激素替代人工周期内膜转化日。

1.2.2操作步骤

外阴和阴道常规消毒后用5 mL注射器连接人工授精软管，抽取重组人G-CSF注射液(瑞白，齐鲁制药有限公司)150 μg ，超声引导下缓慢注入宫腔后卧床休息30 min。

1.2.3子宫内膜准备及胚胎移植

根据患者月经周期特点选择内膜准备方案。月经周期规律、排卵正常患者采用自然周期准备子宫内膜；月经紊乱、排卵异常患者则行雌孕激素替代疗法(即人工周期)准备子宫内膜。囊胎解冻当天超声引导下轻柔将移植管置入子宫腔内，缓慢推注胚胎后停留片刻退出，于胚胎室观察无胚胎遗留后结束。

1.2.4囊胚解冻

移植日行囊胚解冻(Vitrolife，瑞典)，采用David Gardner评分系统对复苏囊胚进行评分。

1.2.5移植后黄体支持及随访

囊胚移植后常规行激素黄体支持，移植后第12天检测血清β-人绒毛膜促性腺激素(hCG)水平判断是否妊娠，β-hCG>25 μg/L诊断为β-hCG阳性，移植1个月后阴道超声观察宫内有孕囊则诊断为临床妊娠。

1.2.6观察指标

观察3组患者妊娠结局，包括移植日内膜厚度、移植胚胎数、种植率、β-hCG阳性率、临床妊娠率、早期流产率、活产率等。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 3组患者一般资料比较

3组患者年龄、体重指数、不孕年限、基础FSH、基础黄体生成素(LH)、基础雌二醇(E2)、基础窦卵泡数、抗苗勒管激素、既往移植周期数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组患者一般资料比较

续表1 3组患者一般资料比较

2.2 3组患者妊娠结局比较

A、B、C组患者β-hCG阳性率、临床妊娠率依次递增，差异均有统计学意义(P<0.05)，3组患者种植率、早期流产率、活产率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 3组患者妊娠结局比较

3 讨 论

RIF指多次移植优质胚胎仍未能成功植入，但其定义尚未统一[5,7]，近年来认可年龄小于40 周岁、连续移植大于或等于 4个优质胚胎(包括新鲜及冷冻胚胎)均未能获得临床妊娠者[5]。胚胎成功种植需高质量胚胎、良好的子宫内膜容受性及母体恰当的免疫改变，其中子宫内膜容受性异常被认为是导致不明原因性RIF的主要因素。随着生殖免疫的发展，人们逐渐认识到宫腔免疫环境异常将影响子宫内膜容受性[8]。CAVALCANTE等[9]认为，宫腔灌注G-CSF可改善子宫内膜容受性，是RIF患者的一种新的免疫治疗方法，但目前对宫腔灌注G-CSF治疗RIF的效果尚存在争议[3,6,10-13]。RIF患者宫腔灌注G-CSF剂量及次数是否影响其疗效尚有待于进一步研究验证。

3.1 RIF患者G-CSF宫腔灌注与未灌注的临床结局

宫腔灌注G-CSF可提高薄型子宫内膜患者体外受精-胚胎移植 (IVF-ET) 助孕的子宫内膜厚度、胚胎种植率及临床妊娠率[14-15]，也可显著提高RIF患者种植率和生化妊娠率及临床妊娠率[13，16-17]，但未增加不明原因性RIF患者活产率[11-12]。基础研究发现，G-CSF通过短暂抑制淋巴细胞、巨噬细胞和辅助性T淋巴细胞2的免疫应答，在胚胎着床和持续妊娠中发挥重要作用[18]。宫腔灌注G-CSF可调节自然杀伤细胞(NK)的细胞毒性及降低干扰素和IL-8的产生[19]；同时可通过增加单核细胞内皮祖细胞与促血管生成基因的表达促进局部血管生成，诱导血管重塑、内膜蜕膜化和改善子宫内膜容受性而有利于妊娠的建立和维持[20-22]。WURFEL等[23]研究表明，RIF患者中出现缺少3个活化型免疫球蛋白样激活受体的概率可达78.0%，对该部分RIF患者行粒细胞治疗后发现其妊娠率明显增加。本研究对连续2次以上移植且累积移植大于或等于4个优质胚胎仍未孕患者常规行宫腔镜及子宫内膜CD138，外周血淋巴细胞(T cells,B cells and NK cells,TBNK) 亚群分析、抗磷脂抗体、抗核抗体谱、同型半胱氨酸、蛋白C和蛋白S等检查。针对不明原因性RIF，经验性行G-CSF宫腔灌注治疗。针对宫腔灌注G-CSF是否改善RIF患者临床结局，本研究发现，宫腔灌注1次或2次的RIF患者β-hCG阳性比例、临床妊娠率明显较未灌注的RIF患者高，3组患者早期流产率、活产率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。然而也有研究表明，宫腔灌注G-CSF不提高非薄型子宫内膜RIF患者的子宫内膜厚度、临床妊娠率和活产率[6]。分析发现其纳入标准并未限制不明原因性RIF患者及未限制移植的胚胎，即纳入了卵裂期和囊胚移植的RIF患者，可能对妊娠率的统计产生偏倚。另一项研究发现，虽然宫腔输注G-CSF或安慰剂患者妊娠率明显高于未灌注G-CSF的患者，但宫腔输注G-CSF的患者流产率明显低于其他两组[3]，分析其原因认为，宫腔灌注本身可能提高妊娠率，G-CSF药物的治疗增加了活产率。

3.2 G-CSF宫腔灌注1、2次的RIF患者临床结局

据文献报道，RIF患者一次性给予G-CSF皮下注射的妊娠率为50.7%，多次应用G-CSF 治疗长期不孕患者和(或)合并连续5次辅助生殖技术助孕失败及缺乏免疫球蛋白样激活受体的患者移植妊娠率进一步增加[24-25]。WÜRFEL[24]研究表明，内膜薄的患者通过增加宫腔灌注G-CSF次数可持续增加子宫内膜厚度而改善临床结局。目前，RIF患者G-CSF宫腔灌注治疗频率有1次/周期[6]和2次/周期[17]，是否增加宫腔灌注的次数而增强疗效？本研究虽然宫腔灌注2次的患者内膜薄于宫腔灌注1次及未灌注的患者，但通过增加宫腔灌注次数可获得较高的β-hCG阳性率和临床妊娠率。因此，临床工作中对连续2次及以上移植大于或等于4个优质胚胎未孕的患者建议给予G-CSF 150 μg宫腔灌注2次治疗，尤其针对自然周期卵泡晚期或行HRT人工周期补充雌激素第12天子宫内膜厚度小于或等于8 mm的患者。

本研究为回顾性分析，由于样本量有限等因素可能使β-hCG阳性率及妊娠率等数据的统计产生偏倚，故尚需设计良好前瞻性的随机临床试验进一步证实。

总之,RIF患者宫腔灌注G-CSF 150 μg可能增加移植周期β-hCG阳性率和临床妊娠率，且宫腔灌注2次效果优于灌注1次者。