韦入菲，黄洁琼，宁 宇，马瑞鑫，石卓华，曾高峰Δ

（广西医科大学 1.公共卫生学院；2.广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科；3.再生医学与医用生物资源开发应用协同创新中心，南宁 530021；4.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021)

脊髓损伤（SCI）是一种发病率高且愈后不良的高致残性疾病，多为猛烈的外力作用于脊柱所致，至今尚无法完全治愈，一旦患上将会给患者的身心健康及其家庭的经济水平造成巨大的负担，此疾病的常规治疗具有治疗周期长、副作用大和治疗费用高等缺点[1-3]。SCI 包括原发性损伤和继发性损伤，其中继发性损伤包括缺血、水肿、炎症和氧化细胞损伤等，是一系列复杂的病理生理过程[4]。继发性损伤阶段是人为干预SCI进展和阻止病灶进一步扩大的主要阶段，而炎症因子的浸润是原发性病灶侵害周围完好脊髓的重要条件[5]。

山楂叶总黄酮（TFHL）提取自山楂叶，是一种易于获取的植物化学物和中药，具有毒性低和副作用少的特点[6]。TFHL具有较为优越的抗炎功能[7]，而在SCI早期炎症的浸润和进展是SCI加重的关键因素[4]，故本研究拟探索TFHL对SCI后的大鼠血液和脊髓中炎症的作用及其对大鼠运动功能的影响。为未来的人群试验和相关机制的研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

山楂叶总黄酮（山西康立生药业有限公司，批号：15200401，纯度≥95%）、ELISA 试剂盒（酶联生物，上海）。

1.2 动物模型的建立与分组

40只（220±20）g的SD大鼠购于广西医科大学实验动物中心动物（生产许可证号：SCXK GUI 2014-0002；动物使用许可证号：SYXK GUI 2014-0003)。所有饲养于清洁级环境，动物饲养环境符合大鼠的作息节律且动物实验获得广西医科大学动物伦理审查委员会的批准。使用完全随机抽样法将大鼠平均分为假手术组、模型组及TFHL低剂量组（25 mg/kg）、TFHL 中剂量组（50 mg/kg）和TFHL 高剂量组（75 mg/kg）。使用改良Allen’s 打击法构建SCI 模型[8]，麻醉大鼠后备皮，以T10 为中心切开约2 cm的手术切口后暴露脊髓，使10 g的克氏针从距脊髓 3 cm的高度自由落体，造成脊髓中度损伤，其中假手术组仅进行脊髓暴露，不打击，形成假手术对照。然后用生理盐水清洗伤口，依次缝合肌肉、筋膜和皮肤。术后3 d 内每天予3 万U 的青霉素钠以预防感染。每天进行辅助排尿，直至大鼠恢复自主排尿。术后3 d，大鼠后肢无条件反射，生命体征平稳则视为模型成功建立。

1.3 给药方式

根据低、中、高剂量组依次配制浓度为10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL 的TFHL 溶液，溶剂为生理盐水。按体重确定每只大鼠的给药量，每天通过灌胃给药一次，持续7 d。模型组和假手术组给予等量的生理盐水作为对照。

1.4 体重记录

使用体重秤称量损伤前及损伤后第1、3、5 和7天的体重，计算每一只大鼠体重相较于损伤前的变化程度。

1.5 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分

按照BBB评分标准评估SCI后大鼠第1、3、5和7天的运动功能依次评判动物后肢各关节活动（0～7分），步态和协调功能（8～13分），运动时爪子的精细运动（14～21分）。由2名能掌握并熟悉运用BBB评分且不了解分组情况的实验人员进行评分。

1.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）

SCI 后第8 天采集大鼠静脉血至含EDTA 的抗凝管中，离心后收集血浆。使用ELISA试剂盒进行IL-4、IL-17A、IFN-γ和TNF-α等炎症因子水平测定。

1.7 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

大鼠SCI 后第8 天以损伤点为中心取下约1.5 cm 的脊髓，称取50 mg 使用TRIZOL®法提取RNA 后进行逆转录，使用逆转录产物cDNA 进行RT-qPCR（StepOne Plus 7500，赛默飞世尔，美国），扩增条件：95 ℃10 min，95 ℃15 s、60 ℃1 min 循环40次。检测IL-4、IL-17A、IFN-γ 和TNF-α 等炎症因子相关基因的表达。本实验所用引物均由Primer Premier 5 设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列（5’～3’）如下：IL-4上游：CAAGGAACACCACGGAGAACGAG，下游：CTTCAAGCACGGAGGTACATCACG、IL-17A：上游：AGTGTGTCCAAACGCCGAG，下游：GTCCAGGGTGAAGTGGAACG、IFN-γ：上游：GGCAAAAGGACGGTAACACG，下游：TCTGTGGGTTGTTCACCTCG、TNFα：上游：CCACGCTCTTCTGTCTACTG，下游：GCTACGGGCTTGTCACTC 和GAPDH：上游：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，下游：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA。

1.8 苏木精—伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE staining）

损伤后第8天，麻醉大鼠后进行生理盐水和4%多聚甲醛灌注，取出以损伤点为中心的脊髓组织约1 cm，固定于4%的多聚甲醛，然后按标准流程制作石蜡切片（3 μm/组织面），进行HE 染色，使用显微镜（Axio Imager M2p）观察组织形态。

1.9 统计学方法

使用SPSS 23.0 进行数据分析。计算均数和标准差，BBB评分和体重数据使用重复测量的方差分析，其他数据则使用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TFHL缓解SCI后大鼠体质量的减轻

SCI 后，与假手术组比较，模型组（P＜0.001）、TFHL低（P＜0.05）、中（P＜0.01）、高（P＜0.05）剂量组体重的减轻程度均显著高于假手术组；经TFHL治疗，与模型组比较，TFHL 低（P＜0.01）、中（P＜0.05）、高（P＜0.01）剂量组体重的减轻程度较模型组低，但TFHL低、中、高剂量组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1）。

图1 SCI后大鼠体重变化情况

2.2 TFHL促进SCI后大鼠运动功能的恢复

SCI 后，与假手术组比较，模型组（P＜0.001）、TFHL 低（P＜0.001）、中（P＜0.001）、高（P＜0.001）剂量组的BBB评分均显著低于假手术组，，经TFHL治疗，与模型组比较，TFHL 低（P＜0.05）、中（P＜0.05）、高（P＜0.01）剂量组的BBB 评分的增长较模型组的快，但不同剂量组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。损伤后第5 天，TFHL 低（P＜0.05）、中（P＜0.05）、高（P＜0.05）剂量组的评分显著高于第1 和3 天；损伤后第7 天，模型组、TFHL 低（P＜0.01）、中（P＜0.001）、高（P＜0.05）剂量组的评分显著高于第5 天；且于损伤后第7 天，TFHL 低（P＜0.001）、中（P＜0.01）、高（P＜0.001）剂量组的评分显著高于模型组（图2）。

图2 SCI后大鼠运动功能恢复情况

2.3 TFHL抑制SCI后血液中大鼠炎症的产生

ELISA结果显示，TFHL低剂量组的IFN-γ（P＜0.05），中剂量组的IL-17A（P＜0.05）和IFN-γ（P＜0.05）水平显著降低，TFHL 中剂量组的IL-4 水平显著升高（P＜0.01）；而各组的TNF-α 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。

图3 SCI后7 d炎症因子的表达量

2.4 TFHL 抑制SCI 后脊髓中炎症相关基因的表达

RT-qPCR结果显示，与模型组比较，TFHL低剂量组的IL-17A（P＜0.01）和TNF-α（P＜0.001），TFHL 中剂量组的IL-17A（P＜0.001）、TNF-α（P＜0.01）和IFN-γ（P＜0.01）及TFHL 高剂量组的IL-17A（P＜0.01）和IFN-γ（P＜0.05）水平显著降低（P＜0.05），TFHL 低剂量组的IL-4 水平显著升高（P＜0.001）（图4）。

图4 SCI后7 d炎症因子mRNA的相对表达量

2.5 TFHL改善SCI后脊髓组织的破坏和神经元的状态

假手术组脊髓结构完整，神经元数量较多、排列规整且形态大小正常；模型组脊髓结构被破坏，灰质内空洞增加，神经元萎缩减少，炎性细胞浸润；与模型组比较，TFHL 低剂量组的脊髓结构更为完整，灰质内空洞的面积和面积有所减少，炎性细胞浸润有所减轻，TFHL中剂量组的结构完整性最佳，灰质内空洞的面积和神经元数量最接近于假手术组，TFHL高剂量组的结构完整性、空洞面积和神经元数量介于模型组和TFHL中剂量组之间（图5）。

图5 SCI后7 d大鼠脊髓的组织形态变化

3 讨论

SCI 通常会导致神经元的破坏和丧失，然后是复杂的继发性损伤，包括炎症、氧化应激和致密胶质瘢痕形成，继发性损伤在初级阶段后的几秒到几个月内发生，对脊髓修复产生负面影响同时也是SCI干预的一个重要时期。其中SCI的炎症反应包括复杂多样的细胞和细胞活动，受损伤类型、时间和空间分布的影响[9]。SCI可诱导炎性级联反应，包括IL-1β、IL-4、IL-10、IL-17A、TNF-α 和IFN-γ 等炎症因子。SCI 引起的炎症可导致SCI 病灶的扩大，使周围区域进一步病变，进而加重脊髓功能障碍[10-11]。故在SCI 后尽快地抑制炎症的表达有助于SCI 的修复。TFHL 作为一种被广泛食用的植物—山楂叶的提取物，具有毒性低、安全性高和廉价等优点，且这些特点及TFHL 在其他疾病治疗上的药效在体内、体外和人体实验上均已得到验证[12-13]。在以往的研究中，TFHL 在心血管疾病治疗相关研究中展示了其优异的抗炎功能[14-15]，因此TFHL可能有治疗SCI的潜能。

在本团队之前，未发现有关TFHL 治疗SCI 的研究，同时为了动物实验的有效剂量更好地外推及人类，在前期研究的基础上[16]，本研究采用灌胃的方式进行给药。在行为学和蛋白水平上用BBB评分、RT-qPCR和ELISA等方法从行为学、基因及蛋白水平等方面探索TFHL对SCI的治疗效果。本研究结果表明，所有剂量组均可促进运动功能的恢复，但剂量组内比较差异无统计学意义（P＞0.05），中剂量的TFHL抑制了大鼠SCI后炎症因子IL-17A和IFNγ的产生且促进抗炎因子IL-4的分泌，可认为TFHL中剂量组效果更佳。组织学观察亦展现了TFHL对于脊髓组织结构完整性及神经元数量和形态的积极作用，相较于模型组，TFHL低、中、高剂量组的组织形态特征均更接近于假手术组，脊髓内空洞减少，神经元数量增多，结构更完整，其中TFHL 中剂量组最佳。

总之，这些结果表明TFHL 可能通过抗炎来促进SCI后大鼠运动功能的恢复。研究的结果为SCI的治疗提供了理论基础和一种潜在的新策略。然而，需要进一步的研究来确定潜在的治疗机制，未来更需进行剂量的转换并在SCI人群中进行相应的临床试验。此外，在未来的研究中，可从基因和病理结构方面对TFHL 的治疗效果进行评价，亦可对TFHL单个组分和联合组分的治疗效果进行评估。