陈 明,许志华,曾晓聪

(广西医科大学第一附属医院心内科，南宁 530021)

Klotho 是1997 年Kuro-o 等发现的一种哺乳动物抗衰老基因[1]，大多数表达于肾脏远曲小管和大脑脉络膜丛。其在细胞内分别有膜结合型Klotho（α-Klotho）、可溶型Klotho（β-Klotho）和分泌型Klotho（γ-Klotho）3种形式蛋白[2-3]。膜结合型Klotho（α-Klotho）主要通过介导骨分泌激素纤维母细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）23的活性来调节钙磷离子。而分泌型Klotho 和可溶型Klotho 主要作为激素释放到体液靶向作用于细胞，从而发挥抗氧化应激、能量代谢和抗炎症等作用[4]。有研究报道，Klotho 表达的降低通过促进M1 型极化加速了糖尿病肾病的进展[5]，表明Klotho 可能存在对巨噬细胞极化调控。

巨噬细胞在遭遇宿主的感染时会在功能上极化为M1 和M2 巨噬细胞。在体外实验中，M1 型巨噬细胞由脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）诱导，M2 巨噬细胞常用白细胞介素4（interleukin-4,IL-4）诱导[6]。每种巨噬细胞表型都具有特定生物标志物定义,M1 型标志物有一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）和CD86[7]。M1 亚型巨噬细胞分泌大量的促炎反应因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1 beta,IL-1β），这些炎症因子会抑制组织再生和伤口修复。M2 表型的标志物包括CD206、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、精氨酸酶1（arginase 1,Arg-1），具有促进组织修复、血管生成和抗炎等多重作用[8]。因此，在炎症的发展中如何调控M1 和M2 型巨噬细胞之间平衡显得尤为重要。本研究主要探讨Klotho 对骨髓来源M1 型巨噬细胞向M2 型巨噬细胞转变的影响，从而为Klotho在临床治疗中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂和主要仪器

从广西医科大学实验动物中心购买无特定病原体（specific pathogen free,SPF）6 周龄C57BL/6J小鼠（许可证号：SYXK 2014-0003）；重组Klotho 蛋白（R&D 公司）；F4/80、CD11b 流式抗体（BD 公司）；DMEM 培养基和胎牛血清（美国Gibco 公司）；iNOS 单克隆抗体、TNF-α 单克隆抗体和Arg-1 多克隆抗体（美国cell signaling Technology 公司）；巨噬细胞集落刺激因子M-CSF（美国PeproTech 公司）；脂多糖LPS（sigma 公司）；全套RT-PCR 试剂（日本TaKaRa 公司）；细胞培养箱（Thermo,美国）；FACSCantoII 流式细胞仪（BD,美国）；酶标仪购于美国Thermo Fisher Scientific 公司；Odyssey 双色红外荧光成像系统购于美国LI-COR公司。

1.2 骨髓来源巨噬细胞培养

取若干只6 周龄左右雄性小鼠，1.25%阿佛丁0.5 mL麻醉后脱颈处死，在细胞超净台上剥离小鼠的股骨和胫骨，酒精灯旁用PBS反复冲洗骨髓腔至骨质透亮，收集冲洗液经100 μm 细胞筛网过滤，于4 ℃，离心7 min得细胞沉淀，然后在细胞沉淀中加入3 mL 红细胞裂解液，混匀冰上静置10 min，然后加入20 mL PBS 液重悬，离心弃上清液，重新10 mL PBS 洗涤1 次，离心。加入含有30 ng/mL MCSF 培养基进行细胞计数铺于6 孔板。3 d 后换液加浓度为30 ng/mL M-CSF 的DMEM 低糖培养基，继续培养4 d后进行实验。

1.3 细胞免疫荧光鉴定BMDMs 并检测TNF-α 和Arg1蛋白表达

收集细胞，用4%多聚甲醛固定15 min，结束后用PBST 洗涤。然后8%左右的山羊血清封闭2 h，孵育F4/80（1∶100）、CD11b（1∶100）、TNF-α（1∶200）、Arg-1(1∶200) 4 度过夜，次日PBS 清洗完后室温避光孵育荧光二抗（1∶200），最后滴加DAPI 1～2 滴，倒置荧光显微镜观察荧光并拍照。

1.4 细胞流式术验证骨髓来源巨噬细胞

收集细胞，取100 万左右细胞置于流式管中，100 μL PBS重悬，设立阴性管，单阳管，各管分别加入0.5 μL PE-F4/80、PE/Cy5-CD11b流式抗体进行单标和双标，避光孵育40 min。300 μL PBS 重悬上机检测。

1.5 骨髓来源性巨噬细胞干预和分组

将BMDMs 细胞分成空白组、LPS 组、LPS+Klotho组，分别对各组进行相应处理。空白组：普通培养基培养6 h 后换新培养基继续培养42 h；LPS组：含LPS（100 ng/mL）的培养基培养6 h，后换成普通血清培养基培养42 h；LPS+Klotho 组，用含LPS（100 ng/mL）的血清培养基培养6 h，后换成含有1 μg/mL Klotho 蛋白培养基培养42 h。上述各组细胞分别收集细胞进行检验。

1.6 RT-qPCR检测IL-10、IL-6、IL-1β、iNOS和Arg-1 mRNA含量

RNA 提取：收集细胞，6 孔板每孔加入1 mL 的RNA 裂解液，收集裂解液并且加入0.2 mL 氯仿，充分震荡成乳白色后静置5 min，在离心机12 000×g离心15 min 完后液体分成3 层，小心吸取上层溶液转移新的离心管并加入1 mL异丙醇，上下混匀静置10 min，然后12 000×g 离心10 min 得RNA 沉淀，1 mL 70%乙醇清洗RNA 沉淀，最后在用20 μL DEPC 水溶解总RNA。RNA 的浓度值和纯度用紫外分光光度计测量，浓度在500～800 ng/μL，OD260/OD280 在1.8～2.0 之间。逆转录：用逆转录试剂将1 000 ng RNA进行逆转录cDNA。RT-qPCR：按说明书设定PCR 上机参数，预变性（95 ℃，30 s），变性（95 ℃，5 s），退火（60 ℃，31 s），40个循环。2-ΔΔCt法分析样本mRNA 含量。选用内参基因GAPDH进行校准。每个实验组设计4 复孔，引物均由生工公司设计合成。引物序列如下：IL-10 正向5’-CAAGGCAGTGGAGCAGGTGAAG-3’，反向5’-CGCTTTGGTGAGTAGACAGAGGTC-3’；IL-6 正向5’-CTT-CTTGGGACTGATGCTGGTGAC-3’,反向5’-TCTGTTGGGAGTGGTATCCTCTGTG-3’；IL-1β 正向5’-AGCTTCAGGCAGGCAGTATC-3’，反向5’-TCATC-TCGGAGCTGTAGTG-3’;iNOS正向5’-ATCTTGGAGCGAGTTGTGGATTGTC-3’，反向5’-TAGGTGAGGGCTTGGCTGAGTG-3’;Arg-1 正向5’-AGACAGCAGAGGAGGTGAAGAGTAC-3’，反向5’-AAGGTAGTCAGTCCCTGGCTTATGG-3’；GAPDH 正向5’-AGAACATCATCCCTGCCTCTACT-3’,反向5’-GATGTCATCATATTTGGCAGGTT-3’。

1.7 Western blotting 检测iNOS 和Arg-1 蛋白表达水平

收集细胞，在冰上加入RIPA（含1%PMSF）裂解液提取BMDMs 总蛋白，离心取上层清液，制作BCA标准曲线并测样本蛋白溶度，15孔板每孔上样量35 μg 蛋白进行电泳分离，电泳结束转移PDVF（0.45 μm）上转膜（100 V，80 min），结束后快速封闭液封闭15 min，孵育Arg-1（1∶1 000）、iNOS（1∶1 000）4 ℃过夜。次日TBST洗涤液清洗3次，每次15 min，孵育荧光二抗（1∶15 000）室温摇床45 min，用双色红外激光成像系统显影，重复4 次，采用GAPDH 作为内参，用Image J 软件对蛋白灰度值分析。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 7 分析数据，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓来源性巨噬细胞形态与鉴定

免疫荧光显示，大多数细胞都是CD11b（绿色）和F4/80（红色）双阳性细胞，细胞呈现不同的多边形不规则形态（图1A）；细胞流式结果显示，用MCSF 刺激因子诱导的骨髓来源性巨噬细胞高表达F4/80 和CD11b,双阳性细胞占总的细胞数目的98.4%（图1B）；普通光镜下观看到诱导成熟骨髓来源性巨噬细胞形态，呈现不规则形态（图1C）。

图1 骨髓来源性巨噬细胞的鉴定和形态

2.2 巨噬细胞极化相关分子mRNA 及相关蛋白表达

RT-qPCR 结果显示，LPS 组的IL-1β、iNOS、IL-6 mRNA 表达量高于空白组（P＜0.001）。而与LPS组相比，LPS+Klotho 组Arg-1 和IL-10 的mRNA 表达量显著增高，iNOS、IL-1β 和IL-6 mRNA 降低（P＜0.001）。与空白组相比，LPS组高表达iNOS蛋白，低表达Arg-1 蛋白；与LPS 组比较，LPS+Klotho组Arg-1 蛋白表达显著增加（P＜0.001），iNOS 蛋白表达降低（P＜0.001），见图2。

图2 3组骨髓来源性巨噬细胞分型相关分子mRNA和蛋白表达情况

2.3 TNF-α和Arg-1蛋白免疫荧光

与空白组相比，LPS 组高表达TNF-α（绿色）。与LPS组相比，LPS+Klotho组降低TNF-α（绿色）的含量，显著提高Arg-1（红色）的表达，见图3。

图3 3组骨髓来源性巨噬细胞TNF-α和Arg-1蛋白表达情况

3 讨论

炎症反应在生物体内有利有弊，适度的炎症可以帮助机体防御病毒和细菌，但过度的炎症造成组织损伤。有相关研究表明，巨噬细胞极化在心血管疾病中产生巨大影响[9-11]。IKKɑ在LPS刺激后调节MEK1/2-ERK1/2 和下游p65 信号级联，通过负调节巨噬细胞极化到M1 表型来防止心肌I/R 损伤的发展[12]。MSC-Exo 通过miR-182 调控toll 样受体4（TLR4）改变巨噬细胞极化状态从而减轻小鼠的心肌I/R损伤[12]。在整个炎症的发生发展中，决定巨噬细胞的极化方向因子很多，比如细胞内的传导信号通路和刺激因子。而巨噬细胞的亚型处于一个动态平衡，最终决定炎症的方向是巨噬细胞向哪一个方向极化。细菌性脂多糖是一种用来诱导炎症的革兰阴性菌的毒素，能诱导巨噬细胞M0向M1型巨噬细胞转变，同时促进细胞因子IL-6、TNF-α 的分泌，以及提高iNOS蛋白的表达，常用来建立细胞炎症模型[13]。在炎症发展的最初阶段，主要是以M1型巨噬细胞为主，但是随着炎症的进展，机体内巨噬细胞会由M1 型巨噬细胞会转换成M2 型巨噬细胞，进而对机体进行修复。所以，在炎症发展的过程中，如何让M1 型巨噬细胞加快结束，促进M2 型巨噬细胞的提前到来成为了现今的研究方向。但是，最新的研究显示，M1型巨噬细胞在体内很难向M2型巨噬细胞转变[14]。所以，如何在疾病炎症中平衡巨噬细胞M1/M2的表型又成为今后的研究热点。

关于Klotho 是否影响骨髓来源性巨噬细胞表型转变的研究尚不多见。因此，本研究采用巨噬细胞集落刺激因子M-CSF 将小鼠骨髓干细胞诱导成巨噬细胞M0，并对其进行流式细胞术和细胞免疫荧光双重鉴定，证实了诱导分离的是骨髓来源性巨噬细胞，符合国际巨噬细胞指南[15]。首先用脂多糖（LPS）刺激M0巨噬细胞成为M1型巨噬细胞，然后用重组Klotho蛋白对M1型巨噬细胞进行干预。本研究结果显示，LPS 显著上调骨髓来源性巨噬细胞M0的TNF-α、IL-6、iNOS表达，提示诱导M0巨噬细胞成M1型巨噬细胞。但是进行Klotho干预后，M1型标志物iNOS 和TNF-α 表达降低。M2 型巨噬细胞标志物IL-10、Arg1 蛋白明显增高，证实了Klotho可抑制LPS 诱导的巨噬细胞向M1 型极化，促进巨噬细胞向M2 型转换，但是具体的调控方式还需要进一步研究。最近关于Klotho 在炎症相关疾病的研究很多，有研究表明，炎症因子TWEAK和TNF-α减低了肾脏Klotho 的表达[16]，与本文研究结果一致。除此之外，Klotho除了抗衰老，还具有特别广泛的功能，包括抗氧化损伤、细胞凋亡、矿物质代谢调节、纤维化和高血压等[3,17-21]，具有广泛的研究前景。

综上所述，Klotho蛋白能够抑制巨噬细胞向M1型极化，促进向M2型巨噬细胞转变，为Klotho治疗心血管疾病提供了体外理论上的支持。