夏弄玉，陈倬，程昊天，潘秋红

（中国农业大学食品科学与营养工程学院葡萄与葡萄酒研究中心/农业农村部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083）

香气物质的组成及含量是衡量葡萄果实及葡萄酒品质的重要指标，直接影响着消费者的认可程度。葡萄果实中的香气物质主要来自类异戊二烯代谢、脂肪酸代谢及氨基酸代谢[1]，分别产生萜烯类和降异戊二烯类物质，直链醛、醇、酯、酸类物质，芳香族类、支链脂肪族类和吡嗪类化合物[2]。香气物质的组成与含量不仅取决于品种、营养系、树龄、砧木和成熟度等内在因素，也受土壤、光照、温度和栽培技术等外在因素的影响[3]，其中，品种在很大程度上决定了葡萄及其加工产品香气的典型性[4]。根据果实中游离态萜烯含量情况，葡萄品种可分为麝香型（游离态萜烯可高达6 mg·L-1）、非麝香芳香型（游离态萜烯通常为1～4 mg·L-1）、非芳香型（游离态萜烯低于1 mg·L-1）。常见的麝香型酿酒葡萄品种包括‘小白玫瑰’‘琼瑶浆’‘亚历山大麝香’等；非麝香芳香型包括‘雷司令’‘肯纳’‘米勒·图高’等；非芳香型包括‘霞多丽’‘赤霞珠’等[5-7]。

关于不同品种之间葡萄果实香气物质组成和含量分析已有很多研究，其中大多是针对当地新引进的或新培育的品种[8]、原产当地的品种[9]、或当地种植较为广泛并具特色的品种[10]。例如Lan等[11]对比了原产于我国的6个刺葡萄品种（白葡萄、高山1号、高山2号、涩葡萄、米葡萄和甜葡萄），发现‘甜葡萄’有相对较高含量的萜烯、降异戊二烯、高级醇和芳香族氨基酸。Ju等[12]对比了刺葡萄不同品种及营养系成熟果实中的脂肪酸及其衍生的C6/C9香气物质发现，‘高山4号’和‘白葡萄1号’中C6、C9的含量相对较高。相似地，关于不同营养系之间果实香气物质也有许多报道，谭伟等[4]对比了5个‘赤霞珠’、3个‘美乐’及3个‘品丽珠’营养系的成熟果实及其所酿葡萄酒的香气物质，结果表明，‘赤霞珠685’‘赤霞珠169’‘品丽珠327’和‘美乐348’在果实香气中表现较好，‘赤霞珠338’‘赤霞珠170’‘美乐181’和‘品丽珠409’在葡萄酒香气中表现较好。上述这些研究多采用成熟果实进行，目的是为品种适应性评价和推广应用提供依据。也有学者比较了当地常见的葡萄品种果实发育过程中香气物质积累的差异[13-14]，以期为栽培调控或葡萄酒生产提供参考。有些研究则着重于不同品种某一类香气物质的积累，例如，Qian等[15]发现，‘香妃’‘摩尔多瓦’‘塔明娜’‘圣诞玫瑰’‘亚历山大麝香’等鲜食品种在果实发育过程中具有“绿叶”气味的己醛、己醇等组分的积累存在差异，且与关键酶基因VvLOXA的表达呈正相关，研究旨在揭示不同品种间果实特定香气物质合成代谢的差异，为代谢调控的深入研究奠定基础。有些学者也探究了不同品种或营养系酿造的葡萄酒香气轮廊的差异[16-19]，但研究结果多基于实验室的小型发酵酒。由上可见，了解品种或营养系间香气物质的异同对于葡萄选育种和适应性评价以及相应葡萄酒产品开发均有重要意义。目前已有的报道涉及的品种很多，结果也不尽相同，原因主要与参照系有关，也受葡萄种植地气候生态条件的影响。由于果实香气物质含量易受环境因素的影响，因此简单地对比各组分含量的差异，难以反映品种或营养系间的内在差别，有必要采用多元统计方法，从众多变量中筛选有价值的信息。

本研究以3个欧亚种白色酿酒葡萄品种麝香型‘小白玫瑰’、非麝香芳香型‘雷司令’和非芳香型 ‘霞多丽’以及它们各两个营养系的果实为试材，采用气相色谱质谱法（GC-MS）结合标准品绝对定量或半定量，分析了4个发育期果实香气物质的含量，采用主成分分析（PCA）探究品种间的差异；采用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）营养系间的差异，以期为葡萄品质评价提供新的思路，也为葡萄果实香气代谢调控研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

葡萄果实分别来源于3个品种的两个营养系：‘小白玫瑰’包括嫁接于‘5BB’砧木上的826和455营养系（简称M826和M455），‘雷司令’为C49自根苗和嫁接于‘1103P’砧木上的C49嫁接苗（简称R-C49和R-1103P），‘霞多丽’包括了嫁接于‘1103P’砧木上的76营养系和嫁接于‘5BB’砧木上的277营养系（简称C76和C277）。于2018年采自北京市海淀区中国农业大学上庄实验站葡萄品种园（40°08′12.15″N，116°10′44.83″E），南北行向，行距2.5 m，株距1.2 m，厂形架式，所有品种和营养系均采用相同栽培管理模式。

1.1.2 试剂

氯化钠、氢氧化钠均为分析纯，购自北京蓝弋化工产品有限公司；D-葡萄糖酸内酯购自中国上海Sangon Biotech公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）、4-甲基2-戊醇（内标）及香气标准品均购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

PAL-1手持糖度计购自日本ATAGO公司；pH计购自上海Mettler-Toledo公司；A11果实研磨机购自德国艾卡公司；TGL-16M高速冷冻离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司；6890GC-5975B MS气相色谱-质谱联用仪购自美国Agilent Technologies公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄果实采集

采样时，在不同果穗的上、下、左、右、前、后位置随机采集果实，每一行的阴面及阳面均匀随机采样。以可溶性固形物含量为基础，结合田间观察到的果实硬度和转色情况，按照改进的E-L系统对果实发育物候期进行判断[20]，分别采集转色前E-L34（开始变软、糖度开始增加）、转色时E-L35（白葡萄果实开始变软褪绿并膨大）和转色后E-L36（中等糖度）、E-L37（接近成熟）的样品各200粒，其中50粒用于可溶性固形物和可滴定酸的测定，剩下的用液氮速冻，并保存于-80℃的冰箱中，用于后续香气物质的检测。

果实在E-L34时可溶性固形物为6.0%～7.7%，可滴定酸为29.03～37.25 g·L-1；E-L35时可溶性固形物为10.1%～12.2%，可滴定酸为16.04～17.5 g·L-1；E-L36时可溶性固形物为13.7%～14.3%，可滴定酸为10.19～10.61 g·L-1；E-L37时可溶性固形物为14.5%～16.2%，可滴定酸为7.25～9.92 g·L-1。

1.3.2 葡萄果实香气物质提取

采用实验室前期建立的方法并适当修改[20]。取冷冻葡萄约50 g，去梗后置于研钵中砸碎去籽，记录粒数、去梗质量及籽质量。加入1 g PVPP（防止氧化褐变）和0.5 g D-葡萄糖酸内酯（避免氧化），并用研磨机磨至粉末状，在整个过程中需加入足量的液氮，使葡萄果实处于冷冻状态。将粉末置于50 mL离心管中，于4 ℃下静置化冻8 h后，在4 ℃、8000 r·m-1条件下离心10 min，取上清葡萄汁。

1.3.3 顶空固相微萃取

依次向15 mL样品瓶中加入1.00±0.01 g NaCl（盐析，促进香气组分挥发），5 mL澄清葡萄汁及10 μL内标（1.0018 g·L-1的4-甲基-2-戊醇水溶液），迅速用带聚四氟乙烯隔垫的盖子密封。样品瓶通过磁力加热40 ℃搅拌30 min，将活化后的顶空固相微萃取头（50/30 μm聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯萃取头，CAR/PDMS/DVB）插入样品瓶顶空部分，在40 ℃下再搅拌30 min进行萃取。萃取完成后，萃取头立即转移至气相进样口进样[20]。

1.3.4 色谱条件

色谱柱为Agilent 19091N-136 HP-INN0Wax Polythylene Glycol（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为250 ℃，解析时间8 min；升温程序：柱箱初始温度为50 ℃，保持1 min，然后以3 ℃·min-1的速度升温至220 ℃，保持5 min；载气为高纯氦气（纯度＞99.999%），流速为1.0 mL·min-1；模式为不分流[20]。

1.3.5 质谱条件

接口温度为280 ℃；以电子轰击离子源（Electron Impact，EI）；电离能为70 ev；离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃；质量扫描范围为30～350 u[20]。

1.3.6 定性定量分析

根据各物质的保留时间、保留指数及质谱信息，与标准品及NIST标准谱库对比进行定性。计算香气物质的峰面积与内标物质峰面积之比，对于已有标准品的香气物质而言，直接将峰面积比代入标准曲线进行绝对定量；对于没有标准品的香气物质，利用具有相同官能团或相似碳原子数的标准品进行相对定量（半定量）[20]。采用模拟汁（200 g·L-1葡萄糖，7 g·L-1酒石酸，用5 mol·L-1NaOH溶液调节pH至3.3）配制混合标准品溶液，并稀释至12个梯度[21]；设置与样品同样参数条件进行上机，得到香气标准品每个浓度对应的峰面积比后，经拟合得到标准曲线。每个数据点来自于两个生物学重复和两个技术重复的平均值。

1.4 数据处理与统计分析

香气物质定性采用A M D I S软件，定量采用ChemStation，用IBM SPSS Statistics 21进行独立样本t检验（P＜0.05），用R4.1.0进行单因素AVONA分析（Duncan 检验，P＜0.05），绘制主成分分析（PCA）的得分图，计算各物质载荷得分，绘制柱形图，用SIMCA 14.1进行正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA），用Microsoft Excel 2019对数据进行折线图的绘制。

2 结果与分析

2.1 不同品种果实中香气组成的差异

对所测定的香气物质按类型归类，分析其差异，结果如表1所示。在所检测的4个发育期，萜烯含量始终表现为小白玫瑰＞雷司令＞霞多丽。与预想的一样，萜烯是区分这些品种最主要的香气物质。此外，除E-L34时期，‘小白玫瑰’中直链醇的含量在3个品种中也最高；除E-L37时期直链醛的含量在品种间差异不大之外，在E-L34至E-L36时期，‘小白玫瑰’中直链醛的含量均在3个品种中最低，暗示着‘小白玫瑰’有较强的醛-醇转化活性。而对于降异戊二烯衍生物，其含量并没有明显的品种特异性，但有意思的是，‘雷司令’自根苗R-C49果实中的降异戊二烯不足嫁接苗R-1103P的50%，这表明嫁接有利于该类香气物质的显著积累。而观察各组分含量发现，在所研究的4个发育时期，自根苗R-C49果实中均未检测到香叶基丙酮。在E-L34至E-L35时期，‘霞多丽’中芳香族化合物含量为3个品种最高。

表1 不同品种（营养系）葡萄果实发育过程中不同类型香气物质含量的差异Table 1 Differences in contents of different type aroma compounds in grape berries of cultivars (clones) during development μg·kg-1

2.2 不同品种果实香气物质的PCA分析

为直观地了解不同品种香气物质在不同发育阶段的整体差异，分别以4个发育期所检测到的所有香气物质为变量，对不同葡萄果实中的香气物质进行PCA分析，结果如图1所示。PC1和PC2分别解释了总方差的33.23%～35.38%和14.86%～17.95%。在E-L34至E-L37时期，‘小白玫瑰’可以清楚地通过PC1与‘雷司令’和‘霞多丽’分开。毫无疑问，‘小白玫瑰’的香气物质谱与另两个品种有非常明显的不同，这是该品种的基因型决定的；从E-L35时期开始，M455和M826产生了分离，暗示着随着果实发育，‘小白玫瑰’营养系中香气物质积累差异增大。‘雷司令’和‘霞多丽’两品种处于PC1正轴。值得注意的是，随着果实发育进程，在PC2上逐渐靠近，表明它们之间香气物质谱的整体差异在缩小。

图1 不同发育期3个品种果实中香气物质的PCA分析Figure 1 The PCA analysis of the aroma compounds in grape berries of three cultivars in different growth stages

续表2

续表2

为进一步了解在PCA中品种间差异的主要组分，将在PC1上得分绝对值大于0.19的物质进一步分析。如表2所示，在4个发育期，‘小白玫瑰’与另外两个品种之间有21个差异明显的香气物质，其中，降异戊二烯类的6-甲基-5-庚烯-2-酮和18个萜烯类化合物（D-柠檬烯、别罗勒烯、α-萜品油烯、α-萜品烯、γ-萜品烯、cis-β-罗勒烯、trans-β-罗勒烯、二氢对伞花烃、对伞花烃、cis-氧化里那醇、香茅醇、香叶醇、4-萜品醇、trans-呋喃型氧化里那醇、橙花醚、β-水芹烯、α-萜品醇、β-里那醇）均显著高于‘雷司令’和‘霞多丽’；而除cis-氧化里那醇、香茅醇、香叶醇、4-萜品醇、trans-呋喃型氧化里那醇、橙花醚在‘雷司令’和 ‘霞多丽’中的含量差异不明显外，其他萜烯在‘雷司令’中的含量均显著高于‘霞多丽’。相反，‘小白玫瑰’中邻乙基甲苯和1-壬醇的含量显著低于‘雷司令’和‘霞多丽’。除邻乙基甲苯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-里那醇外，其他物质均对M455和M826之间的差异有所贡献。

表2 葡萄果实主要差异香气物质含量的比较Table 2 Comparison of the content of the main differential aroma compounds in three cultivars

2.3 营养系间果实香气物质的OPLS-DA分析

为了解营养系间的主要差异香气物质，对同一品种两个营养系的香气物质做了进一步的OPLS-DA分析。由图2（A、B、C）可知，同一品种两个营养系之间均能够清楚分开；从图2（D、E、F）中筛选出VIP值大于1的物质，认定其为主要差异香气物质。其中，‘小白玫瑰’和‘霞多丽’不同营养系中的差异香气物质均为C6化合物己醛和(E)-2-己烯醛，而R-C49和R-1103P之间的差异香气物质为苯乙醛、橙花醚、葡萄螺烷、苯甲醛、β-大马士酮。

图2 不同营养系葡萄果实发育过程中香气物质的正交最小偏二乘分析Figure 2 The OPLS-DA analysis of aroma compounds in developing grape berries of different clones of different cultivars

进一步分析不同营养系葡萄果实中的差异代谢香气物质在发育过程中的变化（图3）。总体上，M455果实中的己醛和(E)-2-己烯醛的含量要高于M826，其变化趋势有所不同。在M455中，两个化合物均呈现上升趋势，而在M826中的变化趋势呈现先上升后下降的趋势，其含量在E-L36时期达到最高，这与文献报道一致[22]。而在‘霞多丽’中，虽然有些数据点的己醛含量在两个营养系间没有统计学上的显著差异，但总体而言，C277果实中己醛和(E)-2-己烯醛的含量高于C76。

图3 ‘小白玫瑰’和‘霞多丽’不同营养系的果实中己醛和(E)-2-己烯醛的变化Figure 3 The change of hexanal and (E)-2-hexenal content in grape berries of different clones of 'Muscat Blanc' and 'Chardonnay'

‘雷司令’两个营养系之间的主要差异物质有5个。由图4可见，总体上，嫁接的R-1103P中它们的含量要低于自根的R-C49，尤其在后两个时期，R-C49果实中有花香和果香气味贡献的橙花醚、葡萄螺烷、β-大马士酮和苯乙醛的含量明显较高，从这些化合物在果实发育过程中的变化可以认为，嫁接使‘雷司令’果实转色前后橙花醚、葡萄螺烷、β-大马士酮含量下降的幅度增大，而减缓了苯乙醛上升的幅度。

3 讨论

PCA结果表明，‘小白玫瑰’的香气物质谱与‘雷司令’和‘霞多丽’有很明显的不同，主要差别在于萜烯类化合物，这与‘小白玫瑰’作为麝香型葡萄品种的典型代表是相符的。同时，该结果也证实了萜烯受基因型的显著影响[23]，是葡萄香气育种的靶标化合物[24]。萜烯具有玫瑰花、茉莉花、荔枝、柑橘等花果香气味[25]，通过麝香型品种与其他品种的杂交有望改善葡萄的香气品质，获得具有目标香气的新品种。研究也发现，尽管非麝香芳香型‘雷司令’果实中萜烯的含量在4个发育期均显著高于非芳香型的‘霞多丽’，但PCA分析显示，随着果实发育两个品种整体香气物质谱差异缩小，这种现象类似于Kalua等人的研究[14]，他们发现，‘雷司令’和‘赤霞珠’香气物质在转色前差异最大。‘雷司令’中C6醛在转色后比‘赤霞珠’中更为丰富，而‘赤霞珠’中苯类衍生物的含量要比‘雷司令’中更高[14]。本文结果表明，芳香族化合物除与上述报道一致外，直链醛在‘霞多丽’中的含量较高。

图4‘雷司令’不同营养系的果实中差异香气物质变化Figure 4 The change of main differential compounds in berries of different clones of 'Riesling'

降异戊二烯和萜烯均产生于类异戊二烯途径。本研究发现，尽管嫁接降低了‘雷司令’中β-大马士酮的含量，但自根苗R-C49中降异戊二烯类物质的总量只有嫁接苗R-1103P中的50%甚至更低，这主要归因于自根苗果实中香叶基丙酮未检出，原因有待于进一步研究。从本研究结果看，虽然嫁接降低了某些组分的含量，但提高了降异戊二烯类物质的总量，推测可能改变了葡萄果实中香气物质的代谢流向，丰富了葡萄果实中的香气组成。此外，砧木嫁接还可以提高葡萄的抗性[26]。该结果提示我们，降异戊二烯衍生物含量没有明显的品种依赖性，通过品种间杂交改善降异戊二烯衍生物含量将面临极大挑战，而选择合适的砧木嫁接可能是一个有效的手段，而嫁接如何影响降异戊二烯合成代谢，是一个值得进一步研究的课题。

‘小白玫瑰’和‘霞多丽’不同营养系之间的主要差异香气物质均为C6组分己醛和(E)-2-己烯醛，他们均具有青草、绿叶等气味[27-28]。C6醛类物质产生于脂氧合途径，在葡萄果实中含量最为丰富，这是葡萄果实香气物质代谢谱的共同特点[14]，但这类化合物的感官阈值较高，对果实香气品质的直接贡献极其有限，尤其在葡萄酒发酵过程中，C6醛含量迅速下降，转化为相应的醇，或进一步生成感官阈值较低的有果香气味的酯类物质[29-30]。因此认为，无论是对于‘小白玫瑰’还是‘霞多丽’品种，它们的两个营养系对于最终葡萄酒香气感官影响没有明显差异，均可进行后续的推广应用。综上所述，要利用多元统计分析方法对品种、营养系的品质进行评价，而非仅关注单个或单类组分的变化。