姚雪漫，张秋萍, ，蒋建荣，罗 佳，吴春霞，马晓艳

（1.苏州市疾病预防控制中心，江苏苏州 215004；2.江苏省食品安全风险监测重点实验室（非法添加领域）， 江苏苏州 215004）

草莓外观靓丽、香味诱人、口感酸甜多汁，富含氨基酸、胡萝卜素、维生素、钙、铁等营养素，广受消费者的喜爱。草莓种植周期短、经济效益大，为我国“三农”发展做出了巨大贡献，自2003年起，中国的草莓种植面积、草莓产量均位居世界第一[1]。但是在草莓栽培过程中，病害问题易发，如：炭疽病、白粉病、灰霉病、轮纹病、黑斑病等，杀菌剂的使用无可避免[2−3]。截止2021年6月24日，国内登记在草莓上使用的有效期内杀菌剂共有不同企业生产的90个农药制剂[4]，涉及30余种农药有效成分，其中嘧菌酯、嘧霉胺、异菌脲、苯醚甲环唑、啶酰菌胺等在多地的草莓农残监测中检出率较高，在登记范围之外的腐霉利、异菌脲、甲霜灵等农药残留亦有较多检出[5−6]。草莓无果皮保护，其果肉会与杀菌剂直接接触，从而导致草莓膳食风险增大，食品安全问题引发多方关注[7−8]。于今年9月3日实施的最新版《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》GB2763-2021规定了100余项草莓相关农药的最大残留限量，均为国家监管部门抽查监督时重点关注对象。本文综合考虑近年来农药残留监测中检出率较高、GB2763-2021标准涉及、以及国外农残限量要求等多重因素，筛选出32种草莓常用杀菌剂建立快速检测方法，为监管部门准确发现食品中存在的安全隐患提供有力的技术支持，保障人民群众“舌尖上的安全”。

已有研究中，采用气相色谱单级质谱检测方法能够实现草莓中数十种杀菌剂同时测定，但方法定量限普遍较高，崔淑华等[9]建立了大葱及草莓中49种杀菌剂残留量的气相色谱-质谱法测定方法，此方法中部分杀菌剂定量限超过20 μg/kg；Yang等[10]采用气相色谱-质谱法测定了浆果中88中农药残留，其方法定量限在15~20 μg/kg之间，高于日本肯定列表“一律标准”的0.01 mg/kg（10 μg/kg），且单级质谱的分别率较低，易受相近离子干扰；侯雪等[11]报道了21种草莓杀菌剂残留的气相色谱-串联质谱检测方法，其通过对各标准品的全扫描来锁定母离子、子离子，并逐一优化碰撞能量等质谱参数，方法建立过程较为繁琐、耗时，限制了杀菌剂检测的数量，且个别杀菌剂的相对标准偏差接近18%；齐沛沛等[12]采用超高液相色谱-串联质谱方法检测了草莓中腈菌唑、苯醚甲环唑等九种常见杀菌剂，该定量方法的建立亦需单独优化各农药分析条件，限制了杀菌剂的检测数量和效率，且液相色谱串级质谱仪器成本较高，普适性略差。

现有国内外文献及国家标准规范中，在建立多农残同时测定方法时，大多需要使用单组分标准品对化合物的质谱参数进行逐一优化和选择[12−17]，人员的工作量大，且测定的农残数量被限制，难以适应安全监管、风险监测等规模大、时间紧的检测工作要求。对此，气相色谱的保留指数原理可以被合理利用以提高工作效率。保留指数（retention index）是指用于气相色谱法的一种定性参数，表示物质在固定液上的保留行为，且设定正构烷烃的保留指数为其碳数的100倍。理论上，化合物的保留指数只和化合物本身的性质以及色谱柱的固定相有关，与色谱条件以及色谱柱的长度、内径均没有关系，发展至今，各种气相色谱保留指数通用数据库资源丰富[18−19]，可应用于不同气相色谱仪器上。基于保留指数原理，目前已建立起了在复杂基质中定性目标化合物[20]的方法，比如酸奶[21−22]、豆浆[23]、调料[24]等食品中挥发性成分鉴定，香精香料[25]中香气成分分析，中药[26]挥发油成分定性等。然而，农残检测不仅需要定性，更要求获得准确的定量结果以示权威，文献中利用保留指数原理所建立起的定量检测方法有蔬菜中有机磷[27]、植物性食品中部分农残[28]、八角茴香中菊酯[29]，所测定的目标化合物存在种类单一，且草莓中常用杀菌剂腐霉利、啶酰菌胺、腈菌唑等尚未有保留指数方法建立。

本研究利用正构烷烃标准溶液的全扫描数据和待测化合物的保留指数，计算出待测化合物的当前保留时间，以快速建立起草莓中32种杀菌剂的气相色谱-串联质谱定量检测方法，为草莓质量安全风险监测提供技术支持。本方法旨在建立一种无需逐一扫描单组分标准品进行离子确认和参数优化，较常规方法更为高效、简便、快速，且目标化合物的检出限和定量限能够完全满足国内国际各项标准要求的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

QuEChERS耗材包 包括盐包（MgSO4/NaCl/Na Citrate/Sodium dihydrogen citrate，4000 mg/1000 mg/1000 mg/500 mg）、15 mL塑料管（MgSO4/PSA，900 mg/150 mg）、石墨碳黑，BESEP公司；陶瓷均质子 CNW公司；1000 μg/mL C9~C33正构烷烃混标Bepure公司；100 μg/mL环氧七氯B、50 μg/mL杀菌剂混合标准品 Bepure公司；乙腈、乙酸乙酯、正己烷 色谱纯，默克公司；供试草莓样品 分别自路边水果店、农贸市场、超市、网购四种渠道采购，在−4~0 ℃环境中冷藏保存。

GCMS-TQ8040气相色谱-三重四级杆串联质谱仪 岛津公司；八孔台式离心机 热电公司；NEVAP112自动氮吹浓缩仪 Capiler Life Science公司；KB-5010试管振荡器 中国其林贝尔有限公司；QT-1涡旋混合器 上海琪特分析仪器有限公司；HR2195搅拌机 飞利浦公司；AX204电子分析天平 Mettler-Toledo公司；各量程移液枪 Gilson公司；Milli-Q纯水仪 Millipore公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准溶液配制 用乙酸乙酯将50 μg/mL杀菌剂混合标准品稀释成500 μg/L混合标准储备液，并进一步稀释成100 μg/L和1 μg/L混合标准液，用乙酸乙酯将环氧七氯B稀释至5 μg/mL作为内标溶液，用正己烷将C9~C33正构烷烃混标稀释至5 μg/mL，均保存于0~4 ℃冰箱中；综合考虑仪器的灵敏度、待测杀菌剂的限量及报道检出浓度[5−6]等，用空白草莓基质配成浓度为5、10、50、100、200 μg/L的混合标准工作溶液，所购杀菌剂混合标准溶液包含本研究涉及的32种目标成分；待检溶液中加内标浓度为100 μg/L。

1.2.2 样品溶液配制 用搅拌机将草莓样品粉碎并搅拌均匀，取粉碎过的草莓样品10 g于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈、QuEChERS耗材包的盐包、1颗陶瓷均质子，盖上离心管盖，在试管振荡器上剧烈振荡30 min，以4500 r/min常温离心5 min；吸取6 mL上清液至QuEChERS耗材包的15 mL塑料管中，并加入15 mg石墨炭黑，剧烈振荡30 min，以4500 r/min常温离心5 min；吸取2 mL上清液至10 mL试管中，氮吹至近干，加入20 μL内标溶液、1 mL乙酸乙酯复溶，涡旋2 min，转移至2 mL离心管中，以10300 r/min常温离心5 min，吸取上清液至进样瓶。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度280 ℃，进样量1.0 μL，不分流进样，载气为高纯氦气，高压进样压力为49.7 kPa，载气控制方式为恒线速度模式，色谱柱流量为1.0 mL/min，线速度为36.1 cm/s；升温程序：初始温度40 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升温至120 ℃，再以5 ℃/min升至240 ℃，再以12 ℃/min升至300 ℃，保持1 min。

1.3.2 质谱条件 正构烷烃扫描时采用Q3 SCAN模式，其余全部采用多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）；离子源为电子轰击源，离子化能量7 eV，离子源温度230 ℃，质谱传输接口温度280 ℃，碰撞气为氩气，检测器电压相对于调谐结果+0.6 V，溶剂延迟时间为3 min；定量参考离子允许偏差<30%。

1.4 数据处理

本文采用岛津GCMS-TQ8040气相色谱-三重四级杆串联质谱仪的实时分析软件和再解析软件分别进行数据谱图的采集和处理。在2.1中的方法建立后，首先，将混合标准工作溶液各浓度点由低到高顺次进样，采集数据后，在再解析软件中建立各杀菌剂的标准曲线，并自动计算各相关系数；随后，进行方法验证相关实验，通过低浓度混合标准溶液重复进样计算检出限定量限、空白溶液加标重复实验进行精密度准确度验证实验等，所涉及实验数据的统计和计算在Excel 2017版本软件中进行。

2 结果与分析

2.1 方法建立

将5 μg/mL C9~C33正构烷烃混标在1.3仪器条件下进样并采集数据，在再解析软件中识别C9~C33正构烷烃各自的峰并保存数据文件，将该数据文件导入Smart Datebase Pesticides数据库，自动计算并生成含目标化合物预测保留时间及质谱分析参数等信息的方法文件，使用该方法对100 μg/L混合标准液进行检测，获得各组分的实际保留时间，详细信息见表1，无需使用单组分标准品即可确定方法参数。32种杀菌剂的预测保留时间和实测保留时间非常接近，时间差均小于0.05 min，在仪器数据分析软件中可以进行定性识别。

表1 32种杀菌剂的定量离子对、定性离子对、碰撞电压、预测保留时间和实际保留时间Table 1 Quantitative ion pair, qualitative ion pair, collision voltage, the predicted retention time and the actual measured retention time of 32 fungicides

2.2 方法的线性范围和定量限

将草莓样品按1.2.2中方法制备成样品溶液，选用空白草莓基质配成系列浓度的混合标准工作溶液，以目标化合物峰面积对其浓度作线性回归，各杀菌剂在所分析的浓度范围具有良好的线性关系，相关系数r>0.9982；将1 μg/L低浓度混合标准液重复进样10次，所测得信号平均值进行计算，以三倍信噪比（S/N≥3）确定方法检出限（LOD）为0.01~2.91 μg/kg，以十倍信噪比（S/N≥10）确定方法定量限（LOQ）为0.04~9.71 μg/kg（见表2），低于国标方法GB23200.113《食品安全国家标准植物源性食品中208种农药及其代谢物残留的测定气相色谱-质谱联用法》中的定量限10 μg/kg，能满足国内外对草莓中相应农药残留测定的要求。尽管国内登记在草莓上使用的杀菌剂涉及30余种农药成分，但在国内报道文献中，采用气相色谱-串联质谱法所建立起的草莓中多种杀菌剂同时检测的方法较少[11,16]，同时测定的杀菌剂数量也较少；而采用高效液相色谱-串联质谱法所建立的方法[12,30−31]，所用仪器设备昂贵，实验成本高，且与本研究中涉及的杀菌剂种类有所差异。

2.3 方法的准确度和精密度

采用空白样品添加标准溶液的方法，分别对10、50、100 μg/kg三个水平进行加标回收率实验，每个添加水平测定6次，得到该方法三个水平的回收率分别在73.3%~115.9%、70.4%~113.4%、70.3%~117.8%之间，相对标准偏差分别在1.4%~8.1%、0.05%~7.0%、0.01%~8.5%之间，方法的准确度和精密度在可接受范围内，稳定性和重复性良好（见表2）。

表2 32种杀菌剂相关系数（r），检出限，定量限，回收率及相对标准偏差（n=6）Table 2 Correlation coefficient (r), LODs, LOQs, recoveries and RSDs of the 32 fungicides (n=6)

2.4 草莓样品测定

分别从A路边水果店、B农贸市场、C超市、D网购四种渠道采购草莓样品，各均分两份。通过简单调查，选择两种最常用的方式对所购草莓进行清洗，操作如下：方式一，用自来水冲洗表面后，去除草莓蒂；方式二，用自来水冲洗表面并去除草莓蒂后，自来水浸泡10 min，再冲洗一遍。依次将样品编号A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2，所有样品均取平行样检测，按照1.2.2中方法制备样品溶液，上机测试，结果见表3。其中，有检出的杀菌剂为腐霉利、啶酰菌胺、腈菌唑、四氟醚唑，但均未超过国家限值（见表4）。相比于仅用自来水冲洗，经过10 min浸泡的草莓所检出杀菌剂的浓度减少20%以上，图1为B1和B2两个样品的TIC对比图，经过10 min自来水的浸泡，草莓中腐霉利、啶酰菌胺和腈菌唑的含量明显减少。基于上述对比实验结果，消费者清洗草莓时，去蒂后用清水浸泡一段时间再冲洗能够减少杀菌剂残留，可避免一定膳食风险。

表3 草莓样品中32种杀菌剂残留测定结果（μg/kg, n=3）Table 3 Determination results of 32 fungicides in strawberry samples (μg/kg, n=3)

表4 草莓中腐霉利、啶酰菌胺、腈菌唑、四氟醚唑四种杀菌剂的国内外最大残留限量[32]Table 4 Procymidone, boscalid, myclobutanil, tetraconazole maximum residue limits of strawberry in China, EU and US[32]

图1 B1（a）和B2（b）供试样品溶液TIC图Fig.1 TIC chromatograms of B1(a) and B2(b) test solution

续表 2

3 结论

本研究采用QuEChERS前处理方法，并基于保留指数原理建立起气相色谱-三重四级杆质谱联用的快速测定方法，可以同时完成草莓中32种常见杀菌剂残留的定性定量分析。在方法建立时，通过正构烷烃混合标准溶液和100 μg/L杀菌剂混合标准溶液两次进样即可获取各组分保留时间并生成质谱参数方法文件，快速、高效，应用潜力大；方法验证实验中，各杀菌剂在所分析的浓度范围内相关系数r>0.9982，检出限为0.01~2.91 μg/kg，定量限为0.04~9.71 μg/kg，在10、50、100 μg/kg三个水平的加标回收率分别在73.3%~115.9%、70.4%~113.4%、70.3%~117.8%之间，相对标准偏差分别在1.4%~8.1%、0.05%~7.0%、0.01%~8.5%之间，准确度和精密度在可接受范围内；在草莓样品测定中，腐霉利、啶酰菌胺、腈菌唑、四氟醚唑四种杀菌剂有检出，均未超过国家限值；通过简单对比实验比较了两种草莓清洗方式，发现去蒂后用自来水浸泡一段时间再冲洗能够减少杀菌剂残留，避免一定膳食风险。本研究所建立方法的灵敏度、准确度及精密度良好，适用于市售草莓32种常见杀菌剂检测，较现有文献报道[11,16]，扩大了草莓中杀菌剂的同时测定数目，有效降低了工作量，提升检测效率，在农残检测中具有重要的应用价值。