刘秀英，夏 菲，王佳燕，高 雪，孙小飞，李学鹏, ，励建荣，郭晓华，于建洋

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州 121013；2.山东美佳集团有限公司，山东日照 276800；3.荣城泰祥食品股份有限公司，山东威海 264309）

近年来，随着人们生活水平和健康意识的提高，食品的品质和安全问题逐渐成为消费者的关注热点。鱼肉自身味道鲜美，营养价值丰富，被认为是人类饮食中大量重要营养物质的来源之一，广受消费者的青睐[1−2]。然而，由于微生物和酶的共同作用，鱼在贮存过程中易腐败变质，导致货架期的缩短，不仅极大地降低了鱼类产品的经济价值，而且对消费者的生命安全也存在潜在危害[3]。

目前，鱼肉新鲜度的评价主要依靠传统的检测方法，如感官评价法、理化指标法和微生物法[4−5]。该类方法可以提供准确的定量结果[6]，但检测过程繁琐、耗时长，会破坏鱼肉的原有价值[7−9]。因此，基于传统的检测方法都不能满足鱼肉新鲜度的现场快速无损检测。近年来，比色阵列传感器因其成本低、操作简单、响应速度快、无破坏性、灵敏度高等优点成为了监测鱼肉新鲜度的一种有力工具[10−11]。如Zaragozá等[12]以氧化铝和硅胶作为固相载体，基于5种化学响应性染料研制了一种可评估新鲜海鲷货架期的比色阵列传感器。Magnaghi等[13]将多种pH指示剂嵌入阴离子交换纤维素膜中，构建了一种可以监测不同鱼类整腐烂过程的比色阵列传感。Majdinasab等[14]通过在海藻酸盐微球中包裹天然花青素提取物，开发了一种可监测虹鳟鱼新鲜度的新型比色传感器，研究结果表明该比色传感器对鱼肉贮藏过程中的pH值和挥发性胺变化非常灵敏，其微球颜色变化与TVBN和微生物数量结果一致。

比色阵列传感器是一种新兴的嗅觉可视化技术，其组成元素主要包括具有特定识别能力的光学气敏材料和固相载体[15]。目前，用于比色阵列传感器中的光学气敏材料主要包括氧化还原指示剂、金属卟啉、pH指示剂和溶剂变色染料[16−18]。其中，pH指示剂因其结构稳定、价格便宜等优点被广泛地应用于鱼肉新鲜度比色阵列传感器的构建中。其检测机理是，当鱼肉腐败释放的挥发性气体浓度足够高时，附载在固相载体中的pH指示剂会与挥发性气体发生反应并呈现出特定的颜色变化，最终通过区分暴露于样品前后的传感器阵列图像，达到对鱼肉新鲜度的可视化检测[19−23]。固相载体是比色阵列传感器的重要组成部分，对传感器的性能有着重要影响。传统的比色阵列传感器通常以反相硅胶板、石英、玻璃等多孔膜作为固相载体[24−28]，然而这些载体都存在着制备成本高、比表面积低等缺点，导致光学气敏材料分布不均匀，进而影响最终颜色变化不明显的结果。近年来，阳极氧化铝片因比表面积大，孔隙率高，背景色浅，能使光学气敏材料分布更加均匀等优势，成为比色阵列传感器中较好的感官底物[29−30]。

因此，本研究采用一步阳极氧化法制备了纳米多孔阳极氧化铝片，并选取13种指示剂附着于纳米多孔阳极氧化铝片中，构建了一种高效、操作简单、低成本的比色阵列传感器。利用所构建的比色阵列传感器对室温（25 ℃）条件下的大菱鲆鱼肉新鲜度进行了实时无损检测，并结合聚类分析和主成分分析对大菱鲆的新鲜度等级进行区分。最后，将该比色阵列传感器应用于鲤鱼和美国红鱼新鲜度的检测，以检验该比色传感器对其它鱼类实际样品的检测效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铝片（99.99%） 冠泰金属材料有限公司；钛片（99.60%） 宝钛公司；大菱鲆、美国红鱼、鲤鱼 购买于辽宁省锦州市水产市场；氯酚红、溴百里酚蓝、苯酚红、溴酚蓝、中性红、甲酚红、无水碳酸钾 阿拉丁试剂有限公司；溴邻苯三酚 红梯希爱（上海）华成工业发展有限公司；邻苯二酚紫、磷酸钠 国药集团化学试剂有限公司；溴甲酚紫 上海三爱思试剂有限公司；溴酚红 上海金穗生物科技有限公司；甲基红 天津市永晟精细化工有限公司；溴甲酚绿 天津化学试剂有限公司；玫红酸 天津市福晨化学试剂厂；无水乙醇、碳酸钠、氢氧化钠 天津风船化学试剂科技有限公司；硫酸、盐酸 锦州古城化学试剂有限公司。除中性红和甲酚红为化学级试剂外，其余pH指示剂均为分析级试剂。

85-2型磁力加热搅拌器 常州荣华仪器有限公司；DP1000A型直流稳压电源 MESTEK公司；SK 6210HP型超声波清洗器 KUDOS公司；FA3103C型电子天平 上海天美天平仪器有限公司；E-3150型pH计 上海雷磁仪器有限公司；LRH-150型生化培养箱 上海一恒科技有限公司；S4800型扫描电子显微镜 荷兰飞利浦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 阳极氧化铝基材的制备 阳极氧化铝基材的制备方法参考文献[31]并稍加改动，将铝片依次放入无水乙醇和去离子水中超声清洗，再置于含有0.5%氢氧化钠、0.8%碳酸钠和2%磷酸钠的溶液中进行6 min超声（240 W）脱脂处理。将脱脂后的铝片浸泡在0.1 mol/L氢氧化钠溶液中，去除铝片表面的天然氧化铝。此后，将该铝片放入15%碳酸钠和5%磷酸钠的混合溶液中，在60 °C、恒定电压（5 V）下进行10 min的电化学抛光后，用去离子水彻底冲洗，得到具有较好镜面效果的铝片。以预处理后的铝片为阳极，钛片为阴极，在20 ℃，电压15 V，180 g/L硫酸电解液中反应45 min后，用去离子水反复洗涤，室温自然干燥，得到阳极氧化铝片。

1.2.2 阳极氧化铝的表征 采用S4800型扫描电子显微镜对阳极氧化铝片的表面形貌结构进行了观察，观察前阳极氧化铝片进行喷金处理，仪器加速电压为5.0 kV。

1.2.3 传感器阵列的制备 参考Huang等[15]的研究，分别选取溴甲酚绿、邻苯二酚紫、溴酚蓝、玫红酸、溴酚红、溴邻苯三酚红、苯酚红、氯酚红、溴百里香酚蓝、甲酚红、溴甲酚紫、中性红、甲基红13种指示剂构建传感器阵列。以阳极氧化铝片为基材，采用浸染吸附的方法对指示剂进行固定，制备13个阵列点。将裁剪好的13张氧化铝片分别浸泡到浓度为0.5 mg/mL的溴甲酚绿和溴酚蓝溶液；1 mg/mL的溴邻苯三酚红、邻苯二酚紫、溴甲酚紫、甲酚红溶液；2 mg/mL 的溴酚红、甲基红、玫红酸、氯酚红、溴百里香酚蓝、苯酚红和中性红乙醇溶液中，12 h后，取出氧化铝片，室温下自然干燥。将干燥后的13个氧化铝片逐个粘贴到半径为500 mm的圆形孔的模具上，形成排列整齐的比色阵列传感器。

1.2.4 样品预处理 大菱鲆、美国红鱼、鲤鱼经宰杀，去除鱼的头、尾、皮及内脏后，将剩余的每种新鲜鱼肉平均分成两份，分别用于挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的测定以及比色阵列传感器对鱼新鲜度的测定。

1.2.5 挥发性盐基氮的测定 TVB-N的测定方法主要参考国家标准 GB/T-5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》中规定的微量扩散法[32]。每个样品三个平行，取平均值进行结果分析。

1.2.6 比色阵列传感器对鱼新鲜度的测定 将制备好的传感阵列置于放有新鲜鱼肉的托盘中，用保鲜薄膜密封，在25 ℃恒温下贮藏，并每隔2 h用智能手机拍照，采集传感器图像。所有样品均一式三份。

1.3 数据处理

采用Excel和Origin 2018进行数据整理与分析，运用Photoshop提取传感阵列图像的RGB值，比较各阵列点变色前后的RGB值，得到不同贮藏时间下传感阵列颜色变化的差谱图，利用Image J软件提取差谱图中的特征矩阵，并结合Minitab19进行层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）。运用SPSS软件进行差异显著性分析，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 阳极氧化铝的表征

为了比较氧化处理前的铝片、氧化处理后和固定指示剂后的氧化铝片在微观结构上的区别，研究中还分别对以上三种材料进行了扫描电子显微镜分析。图1和图2分别为铝片阳极氧化处理前后和固定了溴甲酚绿指示剂后的氧化铝阵列点（以下简称溴甲酚绿阵列点）的扫描电镜微观结构图。由图1（a）与图1（b）对比可知，未经氧化的铝片表面较平整，经过阳极氧化处理后，铝片表面形成许多形状不规则的孔洞。与铝片相比，阳极氧化铝片具有较大的表面积，有助于进一步对传感指示剂进行附着与固定。图2为固定了溴甲酚绿指示剂后的阳极氧化铝阵列点的微观形貌。从图中可以看出，阵列点的结构仍呈现为不规则的孔洞，这说明溴甲酚绿指示剂的固定并没有对阳极氧化铝片的结构造成破坏。此外，研究中还对除溴甲酚绿以外的其它指示剂处理后的阵列点的微观结构进行观察，结果发现其微观结构与固定溴甲酚绿后的阵列点均相同。该结构将在一定程度上增加了指示剂与待测气体之间的接触面积，有利于提高相互作用效率。

图1 铝片阳极氧化处理前后的扫描电子显微镜图Fig.1 Scanning electron microscope of aluminum sheet before and after anodizing treatment

图2 溴甲酚绿阵列点的扫描电子显微镜图Fig.2 Scanning electron microscopy of bromocresol green array points

2.2 传感器阵列在鱼类样品中的应用

2.2.1 TVB-N的测定 TVB-N是指在酶和微生物的作用下，动物性食品在腐败过程中蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。该指标是反映原料鱼和肉的鲜度的主要指标。我国国家标准根据TVB-N含量将海水鱼的新鲜度分为三个等级。当TVB-N含量低于15 mg/100 g时，海水鱼为新鲜级；当TVB-N的范围在15~30 mg/100 g时，海水鱼为次新鲜级；当其含量超过30 mg/100 g时，海水鱼为腐败级[33]。图3显示了大菱鲆在贮藏过程中TVB-N含量的变化趋势，TVB-N含量随着贮藏时间的延长而逐渐增加。鲜活的大菱鲆经宰杀处理后，测得的TVB-N初始值为6.55 mg/100 g。随着贮藏时间的延长，可以看出TVB-N的含量呈现出先缓慢上升进而迅速上升的趋势。当贮藏时间达到第12 h时，TVB-N值增加到15.23 mg/100 g，因此12 h为鱼肉从新鲜等级降为次新鲜等级的临界点。当贮藏时间超过12 h后，由于微生物的快速生长，TVB-N含量大幅度增加。当贮藏时间达到第22 h时，TVB-N值高达32.85 mg/100 g，超过规定可食用鱼类TVB-N的临界值，鱼肉发生腐败变质，不可食用。

图3 TVB-N随贮藏时间的变化趋势Fig.3 Variation trend of TVB-N with storage time

2.2.2 差谱图响应分析 图4为比色传感阵列对不同贮藏时间大菱鲆鱼肉新鲜度的响应。从差谱图中可以看出，随着贮藏时间的延长，阵列上各个阵列点逐渐产生响应，颜色变化用肉眼即可识别。当贮藏时间低于12 h时，传感阵列上的十三个阵列点并未完全发生响应，此时的TVB-N含量低于15 mg/100 g，鱼肉样品仍处于新鲜状态。当贮藏时间达到12 h时，TVB-N含量超过新鲜等级鱼肉的最大限值，鱼样变为次新鲜等级，此时传感器中的所有阵列点均显现出肉眼可见的颜色。随着时间的延长，鱼样品质逐渐发生变化，TVB-N含量迅速增加。在贮藏时间达到第20 h时，TVB-N含量增加到28.33 mg/100 g，临近次新鲜产品的阈值30 mg/100 g。此时，差谱图中溴甲酚绿、溴酚蓝、氯酚红、中性红和甲基红阵列点分别变为粉红色、蓝色、橙色、深灰色和蓝绿色。当贮藏时间延长到第22 h时，TVB-N含量达到32.85 mg/100 g，鱼肉发生腐败，此时差谱图中的溴甲酚蓝、溴甲酚红、氯酚红和中性红分别变为紫、棕、黄、蓝绿色。以上信息表明，阵列点肉眼可见的颜色变化与大菱鲆的品质变化过程密切相关。因此，将该比色阵列传感器应用于大菱鲆新鲜度的检测具有可行性。

图4 室温下大菱鲆在不同贮藏时间段的比色阵列差谱图Fig.4 Difference spectrum of colorimetric array of turbot at different storage periods at room temperature

2.2.3 多变量分析 为进一步验证比色阵列传感器对鱼新鲜度的定量分析能力，在收集到的39维RGB颜色空间响应数据（13种pH染料×ΔR，ΔG，ΔB，13×3）的3个颜色分量基础上，用Image J提取差谱图输出的特征矩阵进行HCA和PCA分析。

2.2.3.1 HCA分析 HCA是根据样品数据在全维空间中的向量间距离对分析向量进行分组的一种标准统计程序[34]。相似度高的数据被聚类到一组，不同数据之间的相似度越低，聚类分析图上的距离越远。由图5可知，相同贮藏时间的平行样品发生聚集，不同贮存时间的样品间没有发生交叉重叠，证明了该比色阵列较好的稳定性。此外，HCA结果从左到右可以依次划分为三个区间：贮藏时间0~10 h为第一组，此时鱼的等级为新鲜；贮藏时间12~22 h为第二组，此时鱼的等级为次级新鲜；贮藏时间24~28 h为第三组，此时鱼的等级为腐败。综上，该比色阵列传感器可以很好地区分不同贮藏时间的鱼肉。

图5 不同贮藏时间的大菱鲆样品的聚类分析Fig.5 Cluster analysis of turbot samples with different storage time

2.2.3.2 PCA分析 PCA可通过三维主成分散点分布图呈现出不同新鲜度大菱鲆的聚类趋势。如图6（a）所示，第一主成分的贡献率为50.33%，第二主成分的贡献率为12.77%，第三主成分的贡献率为9.48%，累计贡献率72.58%。由此可见，前三个主成分足以表征样本的大部分信息。此外，从图中的样品分布趋势看出，不同贮藏时间的大菱鲆呈现出不同聚类趋势，聚类结果可以清晰地分为3个组别：2~10 h，新鲜组；12~20 h，次新鲜组；22~28 h，腐败组，这一结果与2.2.1中的TVB-N分析结果一致。但是，当贮藏时间为4~10 h时，样本间存在明显的交集区域。因此，我们将4~10 h范围内的样本投影到第一主成分和第三主成分中，得到图6（b）。观察到，4~10 h之间的样品实际上没有发生重叠。综上所述，PCA方法可以较好地区分不同贮藏时间的大菱鲆新鲜度，同时这也证明了本研究所制备的比色阵列传感器应用于鱼新鲜度的指示具有可行性。

图6 不同新鲜度大菱鲆的主成分散点分布图Fig.6 Three-dimensional principal component distribution maps of turbot with different freshness

2.3 比色传感器在鱼类实际样品中的应用

为进一步检验比色阵列传感器在其它鱼类实际应用中的准确性，对不同贮藏时间下的鲤鱼新鲜度进行了检测。图7a为鲤鱼贮藏16 h时的阵列响应结果，此时托盘内传感阵列颜色处于比色阵列差谱图中次新鲜级范围，通过与差谱图比较可知，托盘内传感阵列的显色结果与TNB-N含量为16.20 mg/100 g时的阵列响应结果几乎一致，因此初步推断贮藏16 h时的鲤鱼处于次新鲜状态，预测此时鲤鱼的TVB-N值为16.20 mg/100 g。为进一步验证推断的准确性，实验同时测定了16 h时的实际TVB-N值，将预测的TVB-N值与实际测得的TVB-N值进行差异显著性分析，结果如表1所示，16 h的预测TVB-N值与实际TVB-N值差异性不显著（P>0.05），说明检测结果准确。此外，对贮藏18 h时的鲤鱼进行了同样的验证比较，所测得的阵列传感图见图7b。通过测得谱图与标准差谱图的比较，预测贮藏18 h时的TVB-N值为18.25 mg/100 g，与实际测定TVB-N值进行差异分析后，发现二者没有显著性差异（P>0.05），检测结果准确。由此可以证明，本研究的比色阵列传感器可以适用于不同淡水鱼新鲜度的检测，且检验结果具有良好的准确性。

表1 不同实际鱼类样品的预测TVB-N值与实际TVB-N值的显著性差异分析Table 1 Significant difference analysis between predicted TVB-N value and actual TVB-N value of different actual fish samples

除了在淡水鱼中进行了验证，研究中还对海水鱼的新鲜度监测进行了验证。以美国红鱼为代表，对不同贮藏时间下的美国红鱼传感阵列图进行数据处理得到图7c和图7d。在贮藏时间为20 h时，TVB-N预测值为22.84 mg/100 g，实际值为21.27 mg/100 g，二者差异不显著；在贮藏时间为24 h时，TVB-N预测值为28.33 mg/100 g，实际值为29.11 mg/100 g，二者差异不显著。

图7 比色阵列传感器对不同贮藏时间下的鲤鱼和美国红鱼产生的响应结果Fig.7 Response results of the colorimetric sensor array to common carp and American red fish under different storage time and the standard deviation spectrum

综上所述，本研究所构建的传感阵列与鱼的不同新鲜度之间建立了一种通用的显色关系，即通过比色阵列点的颜色显现结果与标准差谱图的对比就可以简单准确地判别鱼类的新鲜度。

为了更加准确地验证比色传感器对鱼样新鲜程度的识别能力，将传感器阵列点的响应信息特征值（每个点的R、G、B值和欧氏距离）带入大菱鲆标准差谱图特征矩阵中进行HCA分析。将16和18 h下鲤鱼的阵列响应信息带入大菱鲆标准差谱图特征矩阵，结果如图8所示。由图可得，贮藏16和18 h的鲤鱼在聚类过程中没有出现错误分类，分别与贮藏14和16 h的大菱鲆归类为次新鲜度等级。由此说明本研究制备的比色传感器对鱼类新鲜度具有良好的识别能力。

图8 实际样品的聚类分析Fig.8 Cluster analysis of real samples

将贮藏20和24 h下美国红鱼的阵列响应信息带入大菱鲆标准差谱图特征矩阵进行聚类分析，结果如图9所示。由图可以发现，贮藏20 和24 h的美国红鱼在聚类过程中同样没有出现错误分类，分别与贮藏18和20 h的大菱鲆归类为次新鲜度等级。因此可以得出，通过本研究所制备的比色传感器用于鱼类新鲜度的检测具有可行性，对于不同鱼类新鲜度的识别具有正确的判别能力。

图9 实际样品的聚类分析Fig.9 Cluster analysis of real samples

3 结论

本文以阳极氧化铝片为基材，结合13种指示剂，开发了一种新型的可视化比色阵列传感器，应用于大菱鲆鱼肉新鲜度的检测。根据差谱图的颜色变化，用肉眼即可随不同贮藏时间的鱼肉进行新鲜度判别。当传感阵列上的十三个阵列点并未完全发生响应，表明鱼肉属于新鲜等级；当差谱图中的溴甲酚蓝、溴甲酚红、氯酚红和中性红分别变为紫、棕、黄、蓝绿色时，表明鱼肉已经腐败变质。HCA和PCA分析结果也证明了该阵列可用于对不同贮藏时间的鱼肉样品新鲜度的测定。此外，为检验比色传感器对其它鱼类实际样品的检测效果，将该阵列应用于不同贮藏时间下鲤鱼和美国红鱼新鲜度的检测。结果表明，通过传感器阵列预测的TVB-N值与实际TNB-N值无显著性差异，对于不同鱼类新鲜度的识别具有正确的判别能力。综上所述，该比色阵列传感器能够通过肉眼快速、准确地识别不同实际鱼类的新鲜度。