辛丽娜，莫东淑，蒋定之，曾 坚，梁飞燕，蒙初曦

（广西-东盟食品检验检测中心，广西南宁 530021）

近年来由于虾的养殖过程中存在非法过量使用促进生长的性激素等不规范操作，导致虾肉制品中激素残留量超标时有发生[1−4]，诸如“激素虾事件”等，因此虾肉的性激素残留量成为社会关注的热点之一[5−9]。性激素主要是由性腺（睾丸和卵巢）、肾上腺皮质及调控器官产生和分泌的促（抑）性的甾体激素[10]，具有促生长的作用，因此常被用作促进生长剂以加快动物的生长发育，提高饲料的转化利用率，但性激素由于稳定性强、代谢时间长，蓄积于人们体内会影响正常生理激素平衡，严重者将引发癌症[11−14]。我国在2020年农业农村部250号公告[14]已禁止使用己烯雌酚、甲基睾丸酮、群勃龙等化学合成类激素，并规定这些化合物在食品中不得检出。尽管如此，由于商业利益驱动，这些禁药依然屡禁不止[15]。

虾肉基质复杂、性激素种类繁多，各种类化合物前处理步骤[16−17]不同且复杂，目前检测性激素前处理的方法有液液萃取法[18]、固相萃取法[19]和超临界流体萃取法[20−22]等。固相萃取法操作简单、分离效果好且具有选择性，广泛应用于检测复杂基质的前处理。超高效液相-质谱联用法[23−26]具有高效液相色谱法和串联质谱的优点，进一步提升了灵敏度和分离分析效率，简化前处理步骤，且可在同一时间分析多种化合物等特点，已被广泛应用于动物源产品及水产品的药物残留检验[27−28]。

目前，我国有关水产品的性激素检测的国家检验标准有：《农业部958号公告-10-2007水产品中雌二醇残留量的测定气相色谱-质谱法》[29]、《SN/T 1980-2007进出口动物源性食品中孕激素类药物残留量的检测方法高效液相色谱-质谱/质谱》[30]、《SC/T 3029-2006水产品中甲基睾酮残留量的测定液相色谱》[31]、《农业部1163号公告-9-2009动物性食品中己烯雌酚残留检测气相色谱-质谱法》[32]、《SC/T 3020-2004水产品中己烯雌酚残留量的测定酶联免疫法》[33]，均为单一化合物检测。《SN/T 3235-2012出口动物源食品中多类禁用药物残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》[34]对水产品性激素多组分化合物检测，但此标准对本研究的15种性激素只包括其中2种，因此本研究建立的水产品15种性激素提取方法为首次研究，本研究使用固相萃取法对比两种SPE萃取净化柱，对虾肉样品的前处理进行方法研究，结合超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法分析检测虾肉中的15种性激素检测，为水产品性激素多组分检测研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜虾肉 广西沿海地区（包括北海市、钦州市、防城港市）共96批，去掉样品中不可食用部分，取可食用部分，绞碎均质后，−20 ℃冷冻保存，待检测。

15种性激素标准品：雌三醇、雌二醇、炔雌醇、雌酮、炔诺酮、己烯雌酚、左炔诺孕酮、黄体酮、睾丸酮、甲基睾丸酮、群勃龙、醋酸甲羟孕酮、诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙 纯度均大于98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸 色谱纯，美国Thermo Fisher 公司；乙二胺四乙酸二钠、氨水均分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Oasis PRiME HLB （3 mL 60 mg） 美国Waters公司；Captiva EMR-Lipid（3 mL，300 mg） 美国Agilent公司；实验用水 超纯水。

QTRAP 4500液相色谱串联四极杆质谱联用仪美国AB公司；Milli-Q Advantage A10超纯水机德国Millipore公司；PGC753e型电子天平 艾德姆衡器（武汉）有限公司；Multi Reax型全自动振荡器Heidolph公司；X3R型高速冷冻离心机 Thermo公司；Genius NM32LA型氮气发生器 PEAK公司；ATR Autovap S60型多样品自动浓缩仪 力德生物科技（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 混合标准储备液：分别精密称取15种激素标准物质10 mg（精确至0.1 mg），各置于50 mL容量瓶，加适量的甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为200 μg/mL标准储备液。移取标准储备液各5.00 mL，置同一个100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合标准中间液（10.0 μg/mL）。

系列标准工作溶液：分别精密量取适量的混合标准储备液，用空白基质提取液稀释，制得到系列标准工作液。

1.2.2 样品处理 提取：称取样品2.5 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入2 mL 0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，涡旋震荡提取1 min，使样品被打散，再加入8 mL乙腈，涡旋震荡提取5 min，使样品与提取溶剂充分混合后，超声提取5 min，−2 ℃冷冻离心10000 r/min 10 min，取上清液4 mL待净化。

净化：将4 mL上清液转移至Captiva EMR小柱中，在重力作用下自然洗脱流出，再用1 mL 80%乙腈水冲洗柱子，保持3~5秒每滴流出，同时收集全部流出液与洗脱液，于45 ℃氮吹至近干，用30%乙腈水溶液定容至1 mL，放入超声波清洗机中超声提取1 min，0.22 μm微孔滤膜过滤置于进样小瓶中，待测。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 正离子模式液相色谱条件 色谱柱：CAPCE LLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）。流动相：A：甲醇，B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱条件见表1。柱温：35 ℃，流速：0.3 mL/min，进样量：20 μL。

表1 正离子梯度洗脱程序Table 1 Positive ion gradient elution program

1.2.3.2 正离子模式质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI+）；电喷雾电压（IS）：4500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；气帘气（CUR）流速：30 L/min；雾化气（GS1）流速：55 L/min；辅助加热气（GS2）流速：55 L/min。

1.2.3.3 负离子模式液相色谱条件 色谱柱：CAPCEL LPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）。流动相：A：乙腈，B：0.01%氨水溶液，梯度洗脱条件见表2。柱温：35 ℃，流速：0.4 mL/min，进样量：20 μL。

表2 负离子梯度洗脱程序Table 2 Negative ion gradient elution program

1.2.3.4 负离子模式质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI−）；电喷雾电压（IS）：−4500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；气帘气（CUR）流速：35 L/min；雾化气（GS1）流速：50 L/min；辅助加热气（GS2）流速：50 L/min。

15种激素的定性离子、定量离子与碰撞能量见表3。

表3 15种性激素定性、定量离子和质谱信息Table 3 15 kinds of qualitative and quantitative ion of sex hormone and mass spectrum information

1.3 数据处理

使用MultiQuant3.0.2分析软件对数据进行定量定性分析。

2 结果与分析

2.1 质谱离子源参数的选择

本研究测定目标化合物较多，极性相差大，在质谱中的响应差别也较大，要对化合物进行离子源参数优化，将流动相与标准溶液注射泵链接，同时将流动相与标准溶液注入质谱仪中。发现雌激素在负离子扫描模式下响应更高，而雄激素和孕激素在正离子扫描模式下响应更高。因此在正、负模式分开扫描下，对质谱的电喷雾电压、离子源温度、气帘气流速、碰撞能量等一系列参数进行优化，得到了化合物响应值最大时离子源条件见1.2.3，得到最佳质谱条件见表3。质谱图见图1、图2。

图1 15组分正离子总流图Fig.1 15 component positive ion total flow diagram

图2 15组分负离子总流图Fig.2 15 negative ion total flow diagram of components

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择 分别考察CAPCELL PAK C18 MGⅢ-H （3 μm，2.0 mm×100 mm） 、CORTECS®UPLC®HILIC （1.6 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent SB-Aq RRHD （1.8 μm，2.1 mm × 100 mm）、CAPCELLPAK C18 BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）等4 种不同型号色谱柱对相同浓度的标准溶液扫描分析，考察其保留时间和分离效果。结果发现四根柱子中CAPCELLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）测定正离子项目组分保留时间明显缩短，分离度更好，测定负离子项目组分的峰型更好，且可在高pH下使用，因此选用CAPCELLPAK C18BB-H（3 μm，2.1 mm×150 mm）色谱柱进行虾肉样品性激素的检测。

2.2.2 流动相的选择 在流动相系统选择中，考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.01%氨水（负离子）4组流动相，采用多反应监测模式进行试验，结果显示，正离子模式采用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时分离度和响应值最高，而负离子模式采用乙腈-0.01%氨水作为流动相时分离度和响应值较高。所以采用多反应监测模式分开对正、负离子进行测定，梯度洗脱时，通过改变流动相的比例，使15种性激素均获得有效分离，且峰形良好，灵敏度高，利于分辨。

2.3 样品前处理条件的设计

2.3.1 提取溶剂的选择 本实验考察了乙腈、80%乙腈、0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠-乙腈、0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠-2%甲酸乙腈4组溶剂的提取效果，如图3所示，0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠-乙腈提取溶液的平均回收率为93.29%，高于乙腈提取溶液，且实验中发现虾肉在0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠-乙腈较易散开，从而提高了结果准确性。因此选择0.1 mol/L乙二胺四乙酸二钠-乙腈为提取溶液。

图3 不同提取剂对15种性激素回收率的影响Fig.3 Effects of different extractants on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.2 净化条件的选择 本研究选用Oasis PRiME HLB和Captiva EMR这两种SPE固相萃取小柱进行净化效果的对比，通过对比各类化合物回收率来选择最优的净化条件。PRiME HLB具有特殊设计的填料，蛋白和磷脂基质干扰去除率可达90%以上，因此有效地保护了色谱柱的使用寿命，且样品经提取后可直接过柱，简化了净化过程。Captiva EMR作为一种新型的固相萃取柱，具有高选择性的去除脂质基质，且不会造成分析物损失的特点，因此能最大程度减少目标分析物的基质干扰，具有高效的净化效果。

由图4可以看出，用EMR柱净化的回收率比用HLB柱净化的回收率高，且相对稳定，所以选用EMR作为净化柱进行样品净化。

图4 不同净化柱对15种性激素回收率的影响Fig.4 Effects of different purification columns on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.3 固相小柱上样体积的选择 实验还分别考察了样品离心后的上清液吸取量2、2.5、3、4、5 mL上Captiva EMR过滤柱后回收率的对比，由图5可以看出，上清液取4 mL时的回收率最高。所以选择取上清液4 mL转移至Captiva EMR过滤柱中按1.2.2净化操作。

图5 洗脱液体积对15种性激素回收率的影响Fig.5 Influence of eluent volume on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.4 淋洗溶液的选择 淋洗方式进行了直接收集流出液不进行洗脱、1 mL 80%乙腈水冲洗柱子、2 mL 80%乙腈水冲洗柱子三种方式的对比。

由图6可以看出，洗脱方式为收集全部流出液后，再用80%乙腈水冲洗柱子比直接收集全部流出液的回收率高，其中1 mL比2 mL的洗脱液回收率数据接近，但1 mL洗脱液回收率较高，因此选用的洗脱液体积为1 mL。

图6 淋洗方式对15种性激素回收率的影响Fig.6 Influence of rinsing methods on recovery rates of 15 sex hormones

2.3.5 定容液的选择 因为定容溶剂可能会使检测中出现溶剂效应，产生溶剂峰、峰展宽、峰分叉，增加噪音响应并降低化合物的灵敏度等现象，所以样品经过提取、净化和氮吹浓缩后,定容溶剂的选择尤为重要。本研究选择用乙腈定容，考察了乙腈浓度为10%、20%、30%、40%、50%时回收率的影响。

由图7可以看出，乙腈浓度为10%、20%、40%、50%时回收率较低，浓度为30%时回收率较高，数据较为平稳，因此选用30%乙腈水为定容浓度。

图7 定容液对15种性激素回收率的影响Fig.7 Effect of constant volume solvent on recovery of 15 sex hormones

2.4 基质效应

采用UPLC-MS/MS分析样品时，基质效应是影响定量结果准确性的重要因素。基质效应（ME）是指在样品测定过程中，由于待测物以外其他物质的存在或其他物理、化学因素直接或间接影响离子化效果，从而影响待测物响应的现象。基质效应的计算公式：其中，Sm和Ss分别表示基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线的斜率。负的结果表示基质抑制效应，正的结果表示基质增强效应。当ME为−20%~20%时为弱基质效应；ME为−50%~−20%或20%~50%时为中等基质效应；当ME<−50%或>50%时为强基质效应。表4为部分药物的基质效应。

由表4可以看出，正离子模式下的化合物表现为弱基质效应，负离子模式下的化合物表现为中等基质效应。其中除丙酸睾酮、醋酸甲羟孕酮、苯丙酸诺龙表现为基质增加效应外，其余均表现为基质抑制效应。因此，本实验采用基质匹配的方法，消除基质效应的影响。

表4 部分性激素的基质效应Table 4 Part of the matrix effect of sex hormones

2.5 方法学验证

2.5.1 标准曲线、检出限和定量限 由于样品基质复杂，存在基质效应，本实验采用空白基质溶液稀释标准溶液，可以消除基质干扰。以目标化合物定量离子的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。称取2.5 g虾肉样品空白基质，分别加入混合标准溶液按1.2.2方法处理样品，制得质量浓度分别为1、2、5、10、20、30、50 μg/kg的基质混合标准曲线。以3倍信噪比（S/N=3）对应的空白样品添加质量浓度作为检出限（limit of detection, LOD），10倍信噪比（S/N=10）为定量限（limit of quantitation，LOQ）。15种性激素的线性方程、线性范围、相关系数见表5。

表5 15种性激素的线性方程、线性范围和相关系数Table 5 Linear equation, linear range and correlation coefficient of 15 sex hormones

本实验在线性范围内，相关系数r均大于0.99，线性良好，检出限范围0.0015~0.436 μg/kg， 定量限范围是0.0051~1.453 μg/kg。

2.5.2 方法回收率和精密度 为评价分析方法的准确性和可靠性,考察了虾肉样品的空白基质在2、4、40 μg/kg加标浓度下15种药物的回收率，每个加标浓度平行测试6次，外标法定量，计算平均回收率与精密度。结果表明，15种药物的平均加标回收率为85.31%~119.84%，相对标准偏差为2.11%~9.86%，见表6。

表6 15种性激素的平均加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 6 Average spiked recovery and relative standard deviation of 15 sex hormones

3 结论

本研究建立EMR固相萃取高效液相色谱-串联质谱法测定虾肉中15种性激素的检测方法。通过设计前处理方法的提取溶剂的选择、净化条件的选择：对比了Oasis PRiME HLB和Captiva EMR的净化效果、淋洗溶液的选择、定容液的选择、如何更好消除基质效应等。结果显示，1 mol/L乙二胺四乙酸二钠-乙腈是最合适的提取试剂，Captiva EMR柱的净化效果最佳，取4 mL上清液过柱后，1 mL 80%乙腈淋洗，30%乙腈定容的提取方法在1~50 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）均大于0.99，方法检出限为0.0015~0.436 μg/kg，定量限为0.0051~1.453 μg/kg，平均回收率在85.31%~119.84%，相对标准偏差为2.11%~9.86%（n=6）。本方法简单快速，为食品检测机构检测应对大批量虾肉中多组分性激素检测提供了技术参考。