吴 婧，刘祚祚，吴 杰，罗秋君，姜 燕,

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理 671000；2.云南树翡翠农林科技有限公司，云南宾川 671600）

滇橄榄（Phyllanthus embicaL.）又名余甘子，大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus），广泛分布于我国南方多个省区，云南和福建产量居多[1]。滇橄榄作为一种重要的药食同源植物资源，含有丰富的微量元素[2]、氨基酸[3]、维生素、黄酮和多酚类物质。现代药理学研究表明：滇橄榄具有保肝、抗氧化、抑菌抗炎、清咽生津、抗糖尿病[4]等多种药理作用[5]。

滇橄榄在加工过程中会产生大量的加工废弃物—滇橄榄果渣。滇橄榄果渣富含膳食纤维，具有降低血液胆固醇含量、增加肠道菌群的多样性[6]、预防结肠癌[7]、改善便秘、预防肿瘤[8]等功效。而且膳食纤维中的植酸、阿魏酸[9]和在肠道微生物的作用下的发酵产物—丁酸对癌症的形成有抑制作用[10]。

目前对果渣中膳食纤维的研究主要有采用化学法提取红树莓果渣水溶性膳食纤维[11]；碱法提取油橄榄果渣膳食纤维，并研究其理化性质和葡萄糖透析延迟指数[12]；刺梨果渣膳食纤维的提取和体外吸附性能的研究[13]等。而对滇橄榄果渣膳食纤维的提取方法及体外吸附性能的研究尚未见报道，故本研究拟从滇橄榄果渣中提取膳食纤维，优化提取工艺，分析膳食纤维的理化性质及体外吸附性能，为滇橄榄果渣膳食纤维在保健食品和医疗领域应用提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

滇橄榄果渣 由云南树翡翠农林科技有限公司提供，滇橄榄品种为“盈玉”。将“盈玉”滇橄榄果渣于60 ℃热风干燥箱中烘干，粉碎过60目筛得滇橄榄果渣粉，密封储存备用；胆固醇标准品（纯度≥99%）、盐酸、95%乙醇、氢氧化钠、乙酸、硫酸钾、硫酸、硝酸、磷酸、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺 均为分析纯，蒙自龙宇试验仪器经营部；耐高温α-淀粉酶（2000 U/g）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、糖化酶（10万U/mL）、纤维素酶（1万U/g） 均为食品级，武汉华翔科洁生物技术有限公司。

CPA324S型分析天平 德国塞利多斯；TG16-WS型高速离心机 上海竣仓电器有限公司；ED115干燥箱 德国BNDER公司；8400型全自动凯氏定氮仪 美国福斯公司；T6新世纪紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Phoenix微波灰化系统 美国CEM公司。

1.2 实验方法

1.2.1 滇橄榄果渣基本成分的测定 水分的测定：GB 5009.3-2016 食品中水分的测定，采用直接干燥法进行测定；蛋白质的测定：GB 5009.5-2016 食品中蛋白质的测定，凯氏定氮法；灰分的测定：GB 5009.4-2016 食品中灰分的测定，灼烧称量法；脂肪含量的测定：GB 5009.6-2016 食品中脂肪的测定，酸水解法；总膳食纤维（TDF）、水不溶性膳食纤维（IDF）及水溶性膳食纤维（SDF）的测定：GB 5009.88-2014 食品中膳食纤维的测定。

1.2.2 滇橄榄果渣膳食纤维的提取 本研究从酸法、碱法、碱性蛋白酶法和纤维素酶法中筛选滇橄榄果渣膳食纤维提取方法。

a. 酸法提取：取1.00 g滇橄榄果渣按1:15（g:mL）料液比加入2% HCl液，70 ℃水解60 min[11]。

b. 碱法提取：取1.00 g滇橄榄果渣按1:25（g:mL）料液比加入8 g/L NaOH溶液，40 ℃水解60 min[11]。

c. 纤维素酶法：取1.00 g滇橄榄果渣按1:30（g:mL）料液比加入pH7.0磷酸盐，加入2.0%的纤维素酶（v/w），50 ℃酶解60 min，加热煮沸10 min灭酶[14]。

d. 碱性蛋白酶法：取1.00 g滇橄榄果渣按1:30（g:mL）料液比加入0.05 mol/L磷酸缓冲液，加入0.2%（v/w）碱性蛋白酶，60 ℃酶解2 h[15]。

将上述所得水解液用4倍体积95%乙醇溶液醇沉4 h，过滤，沉淀用95%乙醇醇洗至中性，于（103±1） ℃干燥至恒重即得TDF。水解液分别进行抽滤，滤饼用三级水水洗至中性，于（103±1）℃干燥至恒重即得IDF；滤液用4倍体积95%的乙醇溶液醇沉4 h，过滤，沉淀用95%乙醇醇洗至中性，于（103±1）℃干燥至恒重即得SDF。IDF和SDF的得率均以产品质量占原料质量的百分数计。

1.2.3 滇橄榄果渣膳食纤维提取单因素和正交优化验证试验

1.2.3.1 单因素实验 在料液比1:25（g:mL）、提取时间60 min和提取温度40 ℃的条件下，考察NaOH浓度为6、7、8、9、10 g/L对IDF和SDF得率的影响。在NaOH浓度8 g/L、提取时间60 min和提取温度40 ℃的条件下，考察料液比为1:15、1:20、1:25、1:30、1:35（g:mL）对IDF和SDF得率的影响；在NaOH浓度8 g/L、料液比1:25（g:mL）和提取温度40 ℃的条件下，考察提取时间为40、60、80、100、120 min对IDF和SDF得率的影响；在NaOH浓度8 g/L、料液比1:25（g:mL）和提取时间60 min的条件下，考察提取温度为40、50、60、70、80 ℃对IDF和SDF得率的影响。

1.2.3.2 正交优化及验证实验 碱液在碱解分离IDF和SDF的同时，还会使部分IDF转化为SDF，使SDF的提取率达到最大，故正交试验以SDF的得率为指标。在单因素实验结果的基础上，进行L9（34）的正交试验（表1）；并进行3次重复性验证性试验，验证最佳工艺的可行性和结果的可靠性。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Level of factors for orthogonal test

1.2.4 滇橄榄果渣及膳食纤维的理化性质及体外吸附性能测定

1.2.4.1 持水力的测定 精确称取0.20 g的果渣、TDF、IDF和SDF于50 mL离心管中，加入5 mL蒸馏水，充分搅拌1 h后，以3500 r/min的转速离心10 min，弃去上层清夜并用滤纸将离心管内壁残留的水分吸干，称质量按式（1）计算持水力（RWHC）[12]：

式中：m为样品干质量，g；m1为样品吸水后质量，g。

1.2.4.2 持油力测定 精确称取0.20 g的果渣、TDF、IDF和SDF于50 mL离心管中，加入4 g植物油，室温下静置1 h，以3000 r/min的转速离心20 min，去掉上层油脂并用滤纸将离心管内壁残留的植物油吸干，称重量，按式（2）计算持油力（ROHC）[12]：

式中：m为样品干质量，g；m2为样品吸油后质量，g。

1.2.4.3 膨胀力的测定 精确称取0.50 g干燥果渣、TDF、IDF和SDF于10 mL量筒中，轻微振荡，保持表面平整，读取干品体积，准确5 mL蒸馏水加入其中，振荡均匀后放置24 h，读取体积，按式（3）计算膨胀力（RSC）[12]：

式中：m为样品干质量，g；V0为样品干样品体积，mL；V1为样品膨胀性后，mL。

1.2.4.4 对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的吸附作用对不饱和脂肪酸的吸附[13]：分别取一定量（W1）滇橄榄果渣、IDF、TDF和SDF于离心管中，加入一定量的植物油，37 ℃静置1 h，4000 r/min离心20 min，去掉上层油，残渣用滤纸吸干油离的植物油，称重得W2，吸油量=（W2−W1）/W1。

对饱和脂肪酸的吸附[13]：分别取一定量（W1）滇橄榄果渣、IDF、TDF和SDF于离心管中，加入一定量的猪油，37 ℃静置1 h，4000 r/min离心20 min，去掉上层油，残渣用滤纸吸干油离的猪油，称重得W3，吸油量=（W3−W1）/W1。

1.2.4.5 对胆固醇的吸附作用 根据GB/T 5009.128-2016 食品中胆固醇的测定（比色法）绘制胆固醇标准曲线为：Y=3.478x−0.0216，R2=0.9948。

吸附效果的测定：将鲜鸡蛋蛋黄用9倍的蒸馏水稀释，充分搅拌成乳液；分别取0.50 g滇橄榄果渣及其膳食纤维（TDF、IDF和SDF）于250 mL的锥形瓶中，加入20 mL稀释蛋黄液，均匀搅拌，调节吸附体系pH模拟胃环境（pH2）和小肠环境（pH7），37 ℃恒温水浴锅中反应2 h，不断搅拌使反应充分，过滤，取1 mL滤液，参照标准曲线法在波长560 nm处比色测定胆固醇含量[13]；按式（4）计算胆固醇的吸附量。

式中：A1为吸附前蛋黄液中胆固醇量，mg；A2为吸附后滤液中胆固醇含量，mg；M为样品质量，g。

1.2.4.6 对亚硝酸盐的吸附作用 根据GB 5009.33-2016 食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定分光光度法绘制NO2−标准曲线为：y=0.0548x−0.0003，R2=0.9996。

吸附效果的测定：分别取0.50 g滇橄榄果渣及其膳食纤维（TDF、IDF和SDF）于250 mL三角瓶中，调节吸附体系pH模拟胃环境（pH2）和小肠环境（pH7），pH2的体系中加入浓度为100 μg/mL的NO2−，pH7的体系中加入浓度为50 μg/mL的NO2−，于37 ℃恒温水浴锅中反应2 h后，各取1 mL样液，按标准曲线的方法在波长538 nm处测定NO2−的浓度[13]。按式（5）计算NO2−吸附量。

式中：A1为吸附前NO2−含量，μg；A2为吸附后NO2−含量，μg；M为称取重量，g。

1.3 数据处理

数据用平均值±标准差表示，采用Origin 2017进行图形处理，用SPSS25.0进行显著性分析，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 滇橄榄果渣的基本成分

滇橄榄果渣的主要成分（表2）是膳食纤维（76.60%），其中IDF的含量为64.88%，SDF的含量为11.72%，IDF/SDF值约为5.5:1，高于油橄榄果渣IDF/SDF值（1.8:1）[12]，但低于竹笋（11.7:1）[16]、大豆皮（21.1:1）[17]和豆渣（8.6:1）[18]中的IDF/SDF值。滇橄榄果渣中SDF的含量较高，且能达到高品质膳食纤维的要求（SDF≥10%）[19]，可以作为一种优质的膳食纤维补充剂。DF特异的化学组成及结构使其具有特定的生理功能，可用于减肥、治疗糖尿病、降低胆固醇和改善肠道微生物菌群[20]。

表2 滇橄榄果渣的基本成分Table 2 Basic components of Phyllanthus emblica Linn. pomace

2.2 滇橄榄果渣膳食纤维提取方法的确定

由图1可知，碱法提取所得的IDF和SDF与纤维素酶法、酸法和碱性蛋白酶法存在显著性差异（P<0.05），这是因为碱液在碱解分离制备IDF和SDF的同时，还能水解果渣中的蛋白质、皂化脂肪，从而获得高纯度的膳食纤维[12]。影响膳食纤维生理功能的重要因素是SDF的占比[21]，故选取碱法提取滇橄榄果渣膳食纤维做进一步的探讨。

图1 不同提取方法对滇橄榄果渣膳食纤维得率的影响Fig.1 Effects of different extraction methods on the dietary fiber yield of Phyllanthus emblica Linn. pomace

2.3 滇橄榄果渣膳食纤维提取条件的优化

2.3.1 单因素实验结果

2.3.1.1 NaOH浓度 由图2A可知，SDF的得率随NaOH浓度的增加而增大，IDF的得率则逐渐减小，在NaOH浓度为8g/L时，SDF的得率达到最大，为18.2%；当NaOH浓度大于9 g/L时，IDF和SDF的得率都趋于平稳。这是由于碱液溶度过低会导致滇橄榄果渣水解不完全，而随着碱液浓度的增加，IDF中半纤维素部分水解，使得部分IDF向SDF转化，SDF的得率增加。当碱液浓度超过一定水平值时，膳食纤维又会进一步分解生成小分子葡萄糖，导致IDF和SDF的得率降低[22]。

2.3.1.2 料液比 由图2B可知，在料液比为1:15（g:mL）至1:25（g:mL）之间时，SDF的得率随着溶剂使用量的增加而增大，而IDF的得率则逐渐减小；在料液比为1:30（g:mL）至1:35（g:mL）之间，SDF和IDF的得率有所增加，当反应体系中存在大量的碱液时，滇橄榄果渣膳食纤维会发生水解，导致膳食纤维损失，从而使提取率降低[23]。但当料液比过大时，会增加醇沉时乙醇的用量[24]。

图2 不同反应条件对IDF和SDF得率的影响Fig.2 Effects of different reaction conditions on IDF and SDF yield of Phyllanthus emblica Linn. pomace

2.3.1.3 提取时间 由图2C可知，随着提取时间的增加，SDF的得率先增加后减少，IDF的得率先减小，后趋于平缓。在60 min时，SDF得率达到最大，为17.31%；当提取时间超过80 min时，SDF和IDF的得率都趋于平缓。当碱解时间过短时，果胶水解不充分，SDF的得率较低；当碱解时间过长时，果胶被裂解，IDF中纤维素和半纤维素会发生轻度水解，导致SDF和IDF提取率降低[22]。

2.3.1.4 提取温度 由图2D可知，随着提取温度不断升高，SDF的得率先减小后增加，IDF的得率先增加后减少，当提取温度超过60 ℃时，IDF的得率不断降低，而SDF的得率不断增加。碱液温度过高，滇橄榄果渣中的蛋白质、色素等成分水解完全，部分IDF向SDF转化，使得SDF得率增加，IDF的提取率降低[24−25]。

2.3.2 滇橄榄果渣膳食纤维提取正交优化及验证试验 由表3可知，影响滇橄榄果渣SDF提取率各因素主次顺序：料液比>NaOH浓度>处理温度>处理时间；碱法制备滇橄榄果渣膳食纤维的最佳条件为A2B3C2D2，但处理时间对滇橄榄果渣的提取影响最低，增加提取时间，SDF的提取率未显著提高，故提取时间选择40 min。综上，碱法提取滇橄榄果渣膳食纤维的最佳条件为：NaOH浓度为8 g/L，料液比为1:35，70 ℃处理40 min，在此工艺下进行3次重复性验证性试验，IDF的得率为61.72%±0.04%，SDF的得率为17.57%±0.03%，在试验范围内重现性良好，说明上述最佳工艺可行，结果可靠，能用于滇橄榄果渣膳食纤维的提取。

表3 正交试验结果分析Table 3 Analysis of orthogonal test results

2.4 滇橄榄果渣及其膳食纤维的水化特性和持油力

水化特性和持油力是衡量膳食纤维生理功能的重要指标，水化特性越强，说明进食膳食纤维后排出的粪便体积大、频率高、质地软，间接减轻直肠和泌尿系统压力，有利于防止便秘和结肠癌的发生[26]。由表4可知，TDF的持水力最低，与滇橄榄果渣、IDF和SDF存在显著性差异（P<0.05）。SDF的持油力最低，滇橄榄果渣的持油力较高。IDF和SDF的膨胀力最低，TDF的膨胀力最高（P<0.05）。滇橄榄果渣、TDF和IDF的持油力均高于复合酶改性后马铃薯膳食纤维（2.89 g/g）[27]，滇橄榄果渣SDF的持油力高于百香果皮SDF（0.88 g/g）[28]，滇橄榄果渣SDF的持水力和持油力均高于香芋皮SDF（2.12、1.68 g/g）[29]；滇橄榄果渣及其膳食纤维均具有较好的水化特性和持油力，能更好的增加与饱腹感有关的激素水平，降低刺激饥饿的激素水平，延迟胃排空，产生饱腹感，预防肥胖；将粪便中的有害物质排出体外，改善肠道功能、缓解便秘等[6]。

表4 滇橄榄果渣及其膳食纤维的水化特性和持油力Table 4 Hydration properties and oil-holding capacity of Phyllanthus emblica Linn. pomace and its dietary fiber

2.5 滇橄榄果渣及其膳食纤维的体外吸附性能

2.5.1 滇橄榄果渣及其膳食纤维对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的吸附作用 能量摄入过多导致肥胖人群的比例逐年增加，而能量中脂肪的占比较大。由表5可知，滇橄榄果渣对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的吸附能力虽然高于TDF、IDF和SDF，但与TDF、IDF之间并不存在显著性差异（P<0.05），橄榄果渣IDF对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的吸附能力均强于豌豆纤维粉IDF（1.75、1.27 g/g）[30]。SDF对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的吸附均低于滇橄榄果渣、TDF和IDF，但高于西番莲果皮SDF对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的吸附能力（1.55、1.29 g/g）[31]。结果说明滇橄榄果渣及其膳食纤维对脂肪具有一定的吸附能力，可以减少机体对脂肪的吸收，预防肥胖，降低慢性疾病的发病机率[32]。

表5 滇橄榄果渣及其膳食纤维对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的吸附能力Table 5 Adsorption capacity of saturated fatty acids and unsaturated fatty acids of Phyllanthus emblica Linn.pomace and its dietary fiber

2.5.2 滇橄榄果渣及其膳食纤维对胆固醇的吸附作用 当人体摄入过多的高脂食物时，食物中过多的胆固醇与血液中低密度脂蛋白结合，形成低密度脂蛋白胆固醇，在血管壁上沉积，导致动脉粥样硬化。膳食纤维通过吸附胆汁酸抑制肠道对胆汁酸的吸收，降低肝中胆汁酸的含量，从而加速分解体内的胆固醇，有效降低人体血清和肝中胆固醇的含量[33]。

由图3可知，在pH2（模拟胃环境）的条件下，SDF对胆固醇的吸附能力显著高于滇橄榄果渣、TDF和IDF（P<0.05）。在pH7（模拟小肠环境）的条件下，滇橄榄果渣对胆固醇的吸附能力显著高于SDF、TDF和IDF（P<0.05）。SDF和TDF在pH2（模拟胃环境）的条件下对胆固醇的吸附高于pH7（模拟小肠环境），可能是由于SDF中部分侧链基团在较高pH下发生解离[34]，从而影响SDF和TDF对胆固醇的吸附。丁莎莎等[35]的研究结果表明，膳食纤维能够吸附胆固醇，可以有效降低血清中胆固醇的含量，减小心血管疾病的发病机率。

图3 滇橄榄果渣及其膳食纤维对胆固醇的吸附能力Fig.3 Adsorption capacity of Phyllanthus emblica Linn.pomace and its dietary fiber on cholesterol

2.5.3 滇橄榄果渣及其膳食纤维对NO2−的吸附作用在胃酸的作用下，亚硝酸盐与蛋白质的分解产物二级胺反应生成亚硝胺，亚硝胺具有强烈的致癌作用，会引起食管癌、胃癌、肝癌和大肠癌等[36]。

由图4可知，在pH2（模拟胃环境）的条件下，各样品对于NO2−的吸附强于pH7（模拟小肠环境），说明膳食纤维对NO2−的吸收主要发生在胃部。两者之间的差异可能是由于DF中阿魏酸引起的，酚酸基团对亚硝基具有较强的吸附作用，但在小肠环境中，由于pH的升高使阿魏酸上的羧基发生解离，增大膳食纤维表面负电荷密度，从而排斥NO2−，影响吸附效果[37]。在pH2的条件下，SDF对NO2−的吸附能力最强，达197.82 μg/g；滇橄榄果渣、TDF和IDF对NO2−的吸附无显著性差异（P>0.05）。在pH7（模拟小肠环境）的条件下，TDF、SDF和IDF对NO2−的吸附能力接近，滇橄榄果渣的吸附能力最小（P<0.05）。在pH2和pH7的条件下，滇橄榄果渣SDF对NO2−的吸附能力均强于玉木耳根SDF（23.41、21.73 mg/kg）[38]；滇橄榄果渣IDF对NO2−的吸附均低于黑糯米米糠IDF（348.5、346.96 μg/g）[39]。由此可知，滇橄榄果渣及其膳食纤维能有效减少亚硝酸盐在胃中的分解，降低亚硝酸盐对人体造成的伤害。

图4 滇橄榄果渣及其膳食纤维对NO2-的吸附能力Fig.4 Adsorption capacity of PhyllanthusemblicaLinn.pomace and itsdietaryfiber sonNO2-

3 结论与讨论

本研究通过提取方法的选取确定碱法为最佳提取方法，并通过单因素实验、正交优化及验证性试验确定最佳提取条件为最优提取条件为NaOH浓度为8 g/L，料液比为1:35（g:mL），70 ℃处理40 min，在此条件下IDF和SDF的得率分别为61.72%±0.04%、17.57%±0.03%；滇橄榄果渣及其膳食纤维对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸都具有一定的吸附能力，可减少机体对膳食中脂肪的吸收，预防肥胖。滇橄榄果渣及其膳食纤维样品在模拟胃环境和小肠环境的条件下对胆固醇的吸附能力有所差别，滇橄榄果渣SDF在模拟胃环境的条件下对胆固醇有较好的吸附能力，说明膳食纤维对胆固醇的吸附与pH有关。四个样品在模拟胃环境的条件下对NO2−的吸附都强于模拟小肠环境，表明膳食纤维对NO2−的吸收发生在胃环境中，与周笑犁等[13]的研究结果一致。

综上，滇橄榄果渣及其膳食纤维有较好的水化特性和持油力，能够有效降低机体对脂肪的吸收和血液中胆固醇的含量，还能减少NO2−在胃和小肠中的分解，说明滇橄榄果渣膳食纤维可以作为优质的膳食纤维补充剂，在预防肥胖、降低心血管疾病、慢性病、结肠癌的发病率等方面具有积极的作用。下一步将探讨滇橄榄果渣膳食纤维的抗氧化活性和润肠通便功能，为滇橄榄果渣膳食纤维在医疗和保健食品中的开发利用提供更充分的理论依据。