刘路路，李 可，韦智江，郭 然，赵梓邯，代 熙，李卫东

（北京中医药大学中药学院，中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京102488）

连翘叶是木犀科植物连翘（Forsythia suspensa（Thunb.） Vahl）的干燥叶片。《中华本草》记载“连翘茎叶，性寒，主治心肺积热”[1]。连翘叶的生物活性成分包括苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类、有机酸类、萜类等化合物[2−3]。现代药理研究表明连翘叶具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保肝、降血糖血脂等作用[4−9]。连翘叶生物量大，活性多样，但由于连翘的主要用药部位是果实，生产中大量连翘叶被丢弃，目前其开发利用仅限于小部分地区连翘茶的应用，这造成了极大的资源浪费及巨大的经济损失[10−11]。2017年，国家正式批准连翘叶作为新资源食品，为连翘叶的深度开发利用提供了理论依据和政策支持。

目前连翘叶多采用热水浸提、回流等效率较低的方法进行提取，而超声作为一种提取效率高、耗时短、应用范围广的方法，在连翘叶上的应用研究较缺乏。此外，连翘叶的提取多针对连翘酯苷A、连翘苷等单一成分[12−15]，有关连翘叶多指标成分的提取工艺研究报道较少。研究表明，连翘叶中连翘酯苷A、连翘苷和芦丁的含量均高于作为药材原料入药的连翘果实中的含量[16]，且具有抗氧化[7,17−19]、抗菌抗病毒[5−6,20]、降血脂[21]、神经保护[22−23]等多种药理活性，共同构成连翘叶发挥临床疗效的物质基础。因此本研究以此三个活性成分为指标，采用效率高、时间短的超声提取法，对提取过程中的关键因素，即乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度加以考察。并采用熵权法计算连翘酯苷A、连翘苷和芦丁的相关权重，结合Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM），优选提取工艺，为连翘叶资源的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

连翘叶 2020年8月采自山西省安泽县，经北京中医药大学李卫东研究员鉴定为木犀科连翘属植物连翘的叶，置通风处阴干，粉碎过4号筛，低温储存备用；连翘酯苷A（批号：PS000582）、连翘苷（批号：PS000579） 成都普斯生物科技公司；芦丁（批号：T27F10Z81699） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇分析纯，北京化工厂；醋酸 分析纯，北京化学试剂公司；乙腈 色谱纯，Fisher Scientific公司；娃哈哈纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司。

Waters alliance型高效液相色谱仪、Waters 2998 PDA检测器、Empower软件系统 美国Waters公司；BT25S型1/100000电子分析天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司；HH-S4A型电热恒温水浴锅北京科伟永兴仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ型真空泵 上海亚荣生化仪器厂；DFY-200C型摇摆式高速粉碎机 温岭市林大机械有限公司；FD-2A型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC含量测定方法的建立

1.2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取连翘酯苷A、连翘苷及芦丁对照品适量，加甲醇制成每1 mL含连翘酯苷A 1.880 mg、连翘苷0.700 mg和芦丁1.000 mg的混合对照品溶液。

1.2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取连翘叶粉末（过4号筛）1 g，置于50 mL锥形瓶中，于一定乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度条件下超声提取，冷却后于4 ℃下以8000 r/min转速离心20 min，移出上清液后定容至100 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，待用。

1.2.1.3 色谱条件 色谱柱：Waters XbridgeTMshield C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）−0.4%乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0~8 min，10%~15% A；8~18 min，15%~22% A；18~25 min，22%~40% A；25~30 min，40%~95% A；30~35 min，95% A）；测定波长：277 nm；体积流量：l mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL[24]。

1.2.1.4 线性关系考察 依次稀释“1.2.1.1”项下混合对照品溶液，分别稀释2、4、8、16、32倍，甲醇溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。精密吸取系列不同质量浓度的混合对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以各对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，进行回归分析。

1.2.1.5 精密度试验 取“1.2.1.1”项下混合对照品溶液，按“1.2.1.3”项下色谱条件进样检测，连续进样6次。计算连翘酯苷A、连翘苷及芦丁峰面积的RSD。

1.2.1.6 重复性试验 取同一批供试品粉末，平行6份。按“1.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1.3”项下色谱条件依次进样检测。计算连翘酯苷A、连翘苷及芦丁的提取量及RSD。

1.2.1.7 稳定性试验 取同一批供试品溶液，按“1.2.1.3”项下色谱条件在0、2、4、6、8、12 h分别进样测定。计算连翘酯苷A、连翘苷及芦丁峰面积的RSD。

1.2.1.8 加样回收率试验 取已知各指标成分含量的连翘叶供试品粉末0.5 g，共6份，精密称定，分别加入等量的连翘酯苷A、连翘苷及芦丁对照品，按“1.2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1.3”项下色谱条件依次进样检测，计算得到连翘酯苷A、连翘苷及芦丁的平均加样回收率及RSD。

1.2.1.9 指标成分的提取量测定 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。采用外标法通过标准曲线回归方程计算各指标成分质量浓度，根据公式计算提取量。

式中：M表示指标成分提取量，mg/g；C表示通过标准曲线回归方程得到的指标成分质量浓度，mg/mL；100为定容的体积；W表示称样量，g。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 不同乙醇浓度对连翘叶中活性成分提取量的影响 液料比30:1 mL/g，提取时间30 min，提取1次，提取温度60 ℃。在其它条件固定的情况下，考察乙醇浓度30%、40%、50%、60%、70%对连翘酯苷A、连翘苷和芦丁提取量的影响。

1.2.2.2 不同液料比对连翘叶中活性成分提取量的影响 乙醇浓度40%，提取时间30 min，提取1次，提取温度60 ℃。在其它条件固定的情况下，考察液料比10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1 mL/g对连翘酯苷A、连翘苷和芦丁提取量的影响。

1.2.2.3 不同提取时间对连翘叶中活性成分提取量的影响 乙醇浓度40%，液料比30:1 mL/g，提取1次，提取温度60 ℃。在其它条件固定的情况下，考察提取时间10、20、30、40、50 min对连翘酯苷A、连翘苷和芦丁提取量的影响。

1.2.2.4 不同提取温度对连翘叶中活性成分提取量的影响 乙醇浓度40%，液料比30:1 mL/g，提取1次，提取时间30 min。在其它条件固定的情况下，考察提取温度20、30、40、50、60 ℃对连翘酯苷A、连翘苷和芦丁提取量的影响。

1.2.3 响应面试验 在单因素实验基础上，以乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为考察因素，各指标成分提取量为评价指标，综合评分（M）为响应值，利用Design-Expert 11.0.4.0软件进行Box-Behnken响应面试验设计，筛选各因素最优组合条件。试验因素与水平见表1。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

1.3 数据处理

每个实验重复3次，响应面优化分析及方差分析采用Design-Expert 11.0.4.0软件，作图采用GraphPad Prism 8.0.1软件。

采用熵权法对多个指标进行客观赋权。首先对数据xij根据式1进行归一化处理，得到归一化数据再根据式2得到标准化数据pij，再根据式（3）计算第j个指标的信息熵Hj，得到的各指标信息熵根据式4转化为熵权wj，即得评价指标的熵值。

式中：xij表示第i次试验时第j个评价指标的提取量值； m in(xi)为第j个评价指标的提取量最小值；max(xi)为 第j个评价指标的提取量最大值；x′ij表示第i次试验时第j个评价指标的归一化值；pijij表示第i次试验时第j个评价指标的标准化值；Hj表示第j个评价指标的信息熵值；wj表示第j个评价指标的熵权值。

2 结果与分析

2.1 HPLC含量测定方法的结果

2.1.1 色谱图 “1.2.1.3”项色谱条件下对照品及样品的色谱图显示3种指标成分在检测波长下分离良好，与对照品保留时间相同，见图1。

图1 混合对照品溶液（A）与供试品溶液（B）HPLC色谱图（277nm）Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A) and sample (B) (277 nm)

2.1.2 线性关系 “1.2.1.4”项下得到各指标成分的回归方程、相关系数（r）及线性范围，见表2，显示连翘酯苷A、连翘苷、芦丁分别在0.058~1.880、0.022~0.700、0.031~1.000 mg/mL范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系

表2 线性关系考察结果Table 2 Results of linear relationship investigation

2.1.3 方法学考察 “1.2.1.5~1.2.1.8”项下得到的精密度、重复性、稳定性和加样回收率结果见表3。结果表明精密度和重复性均良好，供试品溶液在12 h内稳定，加样回收率合格，符合定量分析的要求。

表3 精密度、重复性、稳定性和加样回收率结果Table 3 Results of precision, reproducibility, stability and recovery

2.2 单因素实验结果

2.2.1 不同乙醇浓度对连翘叶多指标提取量的影响由图2可知，连翘酯苷A的提取量随着乙醇浓度的增加先上升后下降，在乙醇浓度为40%时达到峰值，为63.66 mg/g。而连翘苷和芦丁的提取量则随乙醇浓度的增加有较小幅度的增加。这和刘伟霞等[25]的结果基本一致。综合考虑选择最佳乙醇浓度为40%，并将其作为响应面试验研究参数。

图2 不同乙醇浓度对连翘叶多指标提取量的影响Fig.2 Effects of different ethanol concentration on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.2 不同液料比对连翘叶多指标提取量的影响由图3可知，三种成分的提取量趋势基本一致。当液料比增加时，三种成分的提取量先上升后下降或保持平稳。这主要是因为液料比增加，指标成分与溶剂边界层浓度差变大，成分越容易渗透出来，直至成分在溶剂中的扩散达到了平衡，提取量将不再升高。连翘酯苷A和连翘苷提取量在25:1 mL/g时达到峰值，分别为56.79和20.97 mg/g。芦丁在20:1 mL/g时达到峰值，为32.17 mg/g。综合考虑选择最佳液料比为25:1 mL/g，并将其作为响应面试验研究参数。

图3 不同液料比对连翘叶多指标提取量的影响Fig.3 Effects of different liquid-solid ratios on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.3 不同提取时间对连翘叶多指标提取量的影响

由图4可知，三种成分的提取量变化趋势较一致，均随着提取时间的延长而增加。这可能是因为指标成分与溶剂边界层存在浓度差，超声时间延长强化了空化和机械效应，有利于有效成分的溶出[26]。三种成分的提取量均在30 min时达到峰值，连翘酯苷A为65.44 mg/g，连翘苷为19.92 mg/g，芦丁为23.30 mg/g。综合考虑选择最佳提取时间为30 min，并将其作为响应面试验研究参数。

图4 不同提取时间对连翘叶多指标提取量的影响Fig.4 Effects of different extraction times on the extraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.2.4 不同提取温度对连翘叶多指标提取量的影响

由图5可知，提取温度对连翘酯苷A提取量影响较显著，对连翘苷和芦丁的提取量影响较小。当温度为50 ℃时，连翘酯苷A提取较完全，为57.88 mg/g。随着提取温度的继续增加，总提取量开始下降，推测其原因可能是连翘酯苷A分子中具有酯键，较高温度易水解[27]。综合考虑选择最佳提取温度为50 ℃，并将其作为响应面试验研究参数。

图5 不同提取温度对连翘叶多指标提取量的影响Fig.5 Effects of different extraction temperature on theextraction amount of multi-index of Forsythia suspense leaves

2.3 响应面试验结果

根据表4进行Box-Benhnken中心组合实验设计，共29个实验点，研究各因素对连翘叶连翘酯苷A、连翘苷、芦丁提取量和综合评分M的影响。响应面试验设计及结果见表4。

2.3.1 综合评分（M）计算 本实验采用熵权法对多个指标进行客观赋权。熵权法是一种用于衡量指标的离散程度的客观赋权法，离散程度越大，表明该指标对综合评价的影响越大[28]，已广泛应用于提取工艺研究[29−31]。本研究利用信息熵这个工具，计算各项指标的权重，最终计算得到连翘酯苷A、连翘苷及芦丁的权重值分别为0.2022、0.4204、0.3774。按M=连翘酯苷A提取量×0.2022+连翘苷提取量×0.4204+芦丁提取量×0.3774，计算不同试验号下各指标成分综合评分（M），结果见表4。

2.3.2 模型建立及方差分析 利用Design-Expert 11.0.4.0软件对表4中综合评分M进行多元二次回归拟合，得回归方程M=30.48+2.98A+1.47B+0.3811C+1.30D−0.6789AB−0.9088AC−0.9716AD−0.0121BC−0.1739BD−0.5509CD−1.97A2−0.5733B2−0.5891C2−2.43D2（R2=0.9472）。对模型进行方差分析，结果见表5。由表5可知该回归模型极显著，说明其拟合度及预测性良好；模型的一次项A项、B项、D项极显著（P<0.01），C项不显著；交互项均不显著；二次项A2项和D2项影响极显著（P<0.01），B2项、C2项不显著；这表明各因素与综合评分M间并非简单的线性关系。失拟项的P值为0.1922>0.05，对综合评分M影响不显著，说明该模型的拟合度良好，可以利用该模型确定最优提取工艺条件。

表4 Box-Behnken 响应面试验设计与结果Table 4 Box-Behnken response surface test design and results

表5 方差分析结果Table 5 Results of ANOVA

2.3.3 响应面分析与优化 利用Design-Expert 11.0.4.0软件根据模型绘制各因素交互作用对综合评分M影响的响应面图，见图6。响应曲面坡度越大，代表该因素对响应值影响越大。对比图6响应面图曲面坡度可知各因素对综合评分M影响大小为乙醇浓度（A）>液料比（B）>提取温度（D）>提取时间（C）。根据模型拟合结果，预测连翘叶最优提取工艺为乙醇浓度为50.01%，液料比为28.41:1 mL/g，提取24.98 min，提取温度为51.01 ℃，综合评分为31.90。

图6 各因素交互作用对综合评分影响的响应面图Fig.6 Response surface plot of the effect of interaction of various factors on comprehensive score

2.3.4 验证实验 取连翘叶粉末3份，按优选的提取工艺进行处理，考虑实际操作，将提取工艺调整为50%乙醇，液料比为28:1 mL/g，提取25 min，提取温度为51 ℃。按此工艺条件重复3次，实验结果见表6。综合评分的实际值与预测值（31.90）的偏差为0.62%。表明该模型基本准确，响应面分析与熵权法相结合得到的连翘叶提取工艺参数稳定、可靠。

表6 工艺验证结果Table 6 Process validation results

3 结论

本研究以连翘叶中三种主要活性成分连翘酯苷A、连翘苷和芦丁的提取量为评价指标，针对乙醇浓度、液料比、提取温度及提取时间进行单因素考察，并在此基础上进行响应面试验优化，得到最佳提取工艺为乙醇浓度：50%，液料比28:1 mL/g，提取温度：51 ℃，提取时间：25 min。该条件下，连翘酯苷A、连翘苷和芦丁的提取量分别为69.69、22.87、22.46 mg/g，综合评分为32.18，符合响应面模型验证结果。影响提取量的四个因素影响程度大小顺序为乙醇浓度（A）>液料比（B）>提取温度（D）>提取时间（C）。该工艺条件简单，操作控制容易，稳定性好，为连翘叶的综合开发利用提供了新途径。