张 萌 颜 蕴

（滕州市中心人民医院妇科，滕州 277500）

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大女性恶性肿瘤，主要由人乳头瘤病毒引起，严重威胁妇女身心健康［1-2］。防止肿瘤细胞免疫逃逸是有效的抗癌方法，逐渐成为肿瘤免疫学研究热点［3］。临床研究发现，宫颈癌患者常发生肿瘤复发和转移，可能与宫颈癌细胞免疫逃逸相关［4］。6，7，4'-三羟基异黄酮（6，7，4'-trihydroxyisoflavone，THIF）是黄豆苷元主要代谢产物之一，其水溶性衍生物THIF-SO3H·2H2O、THIF-SO3（NH4）2对宫颈癌细胞增殖具有抑制作用［5］。此外，宫颈癌细胞中，主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关蛋白A/B（major histocompatibility complex classⅠchain-related protein A/B，MICA/B）可通过淋巴细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞激活可溶性NK 细胞活化性受体（natural killer cell group 2D，NKG2D）发挥免疫防御作用［6］。但THIF对宫颈癌细胞的作用及机制尚不明确，本文旨在通过研究THIF对人宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响，初步探索其与HeLa 细胞免疫逃逸机制的联系，为THIF应用于宫颈癌临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌HeLa 细胞（CBP600232）购自南京科佰生物科技有限公司；THIF（PCS1644）购自成都植标化纯生物技术有限公司；DMEM 高糖培养基（11995）、青链霉素混合液（P1400）、胎牛血清（11011-8611）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（C04915202）购自南京试剂公司；磷酸盐缓冲液（PBS，D1040）、0.25%胰蛋白酶消化液（T1350）、MTT（M8180）、乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒（BC0685）、Trizol 试 剂 盒（R1100）、RIPA 裂 解液（R0020）、逆转录试剂盒（T2210-200T）、Annexin VFITC/PI 凋亡检测试剂盒（CA1020）、Matrigel 胶（356234）均购自北京Solarbio；细胞周期试剂盒（C1052）、ECL 发光液（P0018FS）购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞培养瓶（3815）、96 孔板（3471）、6 孔板（3506）购自美国Corning 公司；兔抗人MICA 多克隆抗体（PA5-35346）、兔抗人MICB 多克隆抗体（PA5-97245）、小鼠抗人NKG2D 单克隆抗体（12587842）、小鼠抗人β-actin 单克隆抗体（AM4302）、山羊抗兔IgG（H+L）二抗（A32731）、山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（A32723）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；CO2细胞培养箱（CR-80）购自广州康恒仪器；酶标仪（ELX-8081U）、PCR 仪（T100）购自美国Bio-Tek；金相显微镜（DM2700M）购自深圳欧博浩瀚科技有限公司；流式细胞仪（CytoFLEX）购自美国Beckman；人外周血取自健康志愿者。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HeLa 细胞置于37℃水浴锅中解冻，1 200 r/min离心5 min，弃上清，高糖DMEM完全培养基（89%高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗）重悬，移入细胞培养瓶，添加2 ml完全培养基，37℃、5%CO2培养，0.25%胰酶消化收集细胞用于后续实验。

1.2.2 MTT 实验 取对数期生长HeLa 细胞，接种于96 孔板（4×104个/孔），随机分组，0.05%DMSO 助溶的含有不同浓度THIF（5、15、30 μmol/L）的无血清培养基培养24 h，设置对照组，各组设6 个复孔。20 μl/孔加入MTT 溶液（5 mg/ml），培养箱孵化4 h，弃上清，加入100 μl DMSO 振动溶解，酶标仪检测490 nm 处各组OD 值，计算细胞存活率（%）=OD药物处理组/OD对照组×100%。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI 双染法检测HeLa 细胞凋亡 收集1.2.1 培养的HeLa 细胞，调整密度为5×105个/ml，2 ml/孔接种于6 孔板，按照1.2.2 随机分组，各组设6 个复孔，培养24 h。收集各组细胞，冷PBS 洗涤3 次，加入500 μl Binding Buffer 重悬，依次加入5 μl Annexin V/FITC 和PI 工作液，避光保存20 min，流式细胞仪检测，计算凋亡率。

1.2.4 MTT检测淋巴细胞增殖能力 参考文献［7］，100 μl PBS 稀释人抗凝外周血，轻铺于含有100 μl淋巴细胞分离液的离心管，1 000 r/min离心15 min，取中间白膜层细胞，PBS清洗3次。收集1.2.3中各浓度THIF 处理的各组HeLa 细胞，制备单细胞悬液（1×103个/ml），与上述淋巴细胞（1×103个/ml）等体积混匀，接种于96孔板（1×103个/孔），各组设6个复孔，培养24 h，MTT法检测细胞存活率。

1.2.5 THIF 作用下NK 细胞杀伤活力检测 参考文献［7］，收集1.2.3 中分离的淋巴细胞，重悬为单细胞悬液（1×106个/ml）。取1.2.3 中各组HeLa 细胞作为靶细胞，制备单细胞悬液（1×106个/ml），分别将不同浓度THIF处理的各组HeLa细胞与淋巴细胞按1∶20 接种于96 孔板（4×104个/孔），并设置对照组，各组设6 个复孔，共培养48 h。收集上清，检测LDH活性（U/L）=（OD实验组-OD对照组）/（OD标准-OD空白）×标准品浓度（0.2 μmol/L）×1 000。

1.2.6 RT-qPCR 检测THIF 对HeLa 细胞MICA/B、NKG2D mRNA 表达的影响 Trizol 法提取各组HeLa细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，以cDNA 为模板进行RT-qPCR 扩增，反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，55℃延伸20 s，72℃退火20 s，40 个循环。以GAPDH 为内参，2-ΔΔCt法计算MICA/B、NKG2D相对表达。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot 检测MICA/B、NKG2D 蛋白表达 收集1.2.2 各组细胞，RIPA 裂解液提取各组HeLa细胞总蛋白，BCA 法检测各组蛋白总浓度。分别取50 μl 样品蛋白进行凝胶电泳，转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭4 h，依次加入兔抗人MICA 多克隆抗体（1∶1 000）、兔抗人MICB 多克隆抗体（1∶1 000）、小鼠抗人NKG2D 单克隆抗体（1∶1 000）、小鼠抗人β-actin 单克隆抗体（1∶1 000），4℃孵化过夜，洗膜，加入山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶1 000）或山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（1∶1 000）室温孵化2 h，ECL曝光显影。以β-actin为内参，计算MICA、MICB蛋白相对表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0 软件分析数据，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较行LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度THIF 对HeLa 细胞增殖的抑制作用 与对照组相比，THIF 各组HeLa 细胞存活率降低，且呈剂量依赖性（P＜0.05，表2）。

表2 不同浓度THIF 处理24 h 对HeLa 细胞存活率的影响（，%）Tab.2 Effect of different concentrations of THIF treatment for 24 h on HeLa cell survival rate（，%）

表2 不同浓度THIF 处理24 h 对HeLa 细胞存活率的影响（，%）Tab.2 Effect of different concentrations of THIF treatment for 24 h on HeLa cell survival rate（，%）

2.2 THIF 对HeLa 细胞凋亡的影响 与对照组相比，THIF 各组HeLa 细胞凋亡率升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05，图1、表3）。

表3 THIF作用24 h后各组HeLa细胞凋亡率（，%）Tab.3 Apoptosis rate of HeLa cell in each group after treatment of THIF for 24 h（，%）

表3 THIF作用24 h后各组HeLa细胞凋亡率（，%）Tab.3 Apoptosis rate of HeLa cell in each group after treatment of THIF for 24 h（，%）

图1 THIF对HeLa细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of THIF on apoptosis of HeLa cells

2.3 淋巴细胞增殖能力 与对照组相比，THIF 各组淋巴细胞活力依次升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05，表4）。

表4 各组淋巴细胞增殖活力（，%）Tab.4 Lymphocyte proliferation activity of each group（，%）

表4 各组淋巴细胞增殖活力（，%）Tab.4 Lymphocyte proliferation activity of each group（，%）

2.4 THIF 对NK 细胞杀伤活力的影响 与对照组相比，THIF各组NK细胞杀伤活力依次升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05，表5）。

表5 各组NK细胞杀伤活力（，U/L）Tab.5 Killing activity of NK cells in each group（，U/L）

2.5 THIF 对HeLa 细胞MICA/B、NKG2D mRNA 表达的影响 与对照组相比，THIF 各组HeLa 细胞MICA mRNA、MICB mRNA 及NKG2D mRNA 表达依次升高，呈剂量依赖性（P＜0.05，表6）。

表6 各组HeLa细胞MICA/B 及NKG2D mRNA 表达情况（）Tab.6 MICA/B and NKG2D mRNA expressions of HeLa cells in each group（）

表6 各组HeLa细胞MICA/B 及NKG2D mRNA 表达情况（）Tab.6 MICA/B and NKG2D mRNA expressions of HeLa cells in each group（）

2.6 THIF 对HeLa 细胞MICA/B、NKG2D 蛋白表达情况的影响 与对照组相比，THIF 各组HeLa 细胞MICA、MICB 及NKG2D 蛋白表达依次升高，呈剂量依赖性（P＜0.05，图2、表7）。

表7 各组HeLa细胞MICA/B及NKG2D蛋白表达（）Tab.7 MICA/B and NKG2D protein expressions of HeLa cells in each group（）

表7 各组HeLa细胞MICA/B及NKG2D蛋白表达（）Tab.7 MICA/B and NKG2D protein expressions of HeLa cells in each group（）

图2 各组HeLa细胞蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoresis of protein expressions of HeLa cells in each group

3 讨论

过去50 年，随着全球医疗条件改善，宫颈癌病死率下降50%～75%，但每年仍有50 万左右女性被确诊为宫颈癌，严重威胁全球女性生命安全［8-9］。目前，根据宫颈癌患者肿瘤情况，临床常采用盆腔淋巴结切除、子宫切除、或放化疗等治疗手段，但患者生存率仍较低［10］。高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持续感染是宫颈癌发生的主要原因，研究显示，宫颈癌发生发展可能与HPV 感染下的肿瘤细胞免疫逃逸相关，但具体机制尚未明确［11-12］。

异黄酮是豆科植物次级代谢产物，具有潜在抗癌、抗肥胖和抗糖尿病活性，近年研究发现，大豆异黄酮可抑制胃癌、肝癌等肿瘤细胞生长，并诱导其凋亡［13］。THIF 是大豆异黄酮主要代谢产物，LEE等［14］和LIM 等［15］研究显示，THIF 可抑制结肠癌HCT-116细胞、食管癌细胞肿瘤活性。本研究发现，THIF 呈剂量依赖性抑制HeLa 细胞存活，提示THIF有望成为抑制宫颈癌肿瘤细胞生长的新型药物。细胞凋亡受抑制是引发癌症的重要因素，因此在肿瘤细胞中维持细胞增殖、凋亡平衡至关重要［16］。LO等［17］首次发现7，3，4'-THIF 可通过激活HeLa 细胞凋亡通路诱导细胞死亡。本研究显示，与对照组相比，THIF 各组HeLa 细胞凋亡率依次升高，提示THIF 是一种潜在的可用于宫颈癌临床治疗的新型药物。

NK 细胞是免疫系统中重要的毒性细胞，可与NKG2D 型配体结合杀灭肿瘤细胞，发挥免疫防御功能［18-19］。NKG2D 型配体包括2 组主要组织相容性复合体Ⅰ类相关分子，MICA/B和6个UL16结合蛋白，其表达受NKG2D 依赖性免疫监测影响［20］。WEISSSTEIDER等［6］证实，宫颈癌细胞可表达控制NK细胞功能的MICA/B 配体和NKG2D 受体。此外，下调NKG2D 表达可诱导宫颈癌细胞免疫逃逸［21］。本研究发现，与对照组相比，THIF 各组淋巴细胞增殖活力、NK细胞杀伤活力依次升高，提示THIF可能通过促进淋巴细胞增殖、激活NK 细胞杀伤功能，抑制HeLa免疫逃逸。CHO等［22］研究证实，宫颈癌患者体内包括MICA/B 在内的NKG2D 配体高表达是良好预后独立预测因子，强调NKG2D功能在宫颈肿瘤进展和癌症免疫检测中的重要性。本研究显示，与对照组相比，THIF各组HeLa 细胞MICA、MICB、NKG2D mRNA 及蛋白表达均呈剂量依赖性升高，提示THIF 可能促进宫颈癌细胞高表达MICA/B，活化NK 细胞表面的NKG2D 受体与MICA/B 配体结合，发挥肿瘤免疫作用，抑制宫颈癌细胞免疫逃逸。

综上所述，THIF 可上调MICA/B 表达，抑制人宫颈癌细胞增殖，促进其凋亡，可能通过活化NK 细胞表面的NKG2D 受体与MICA/B 结合，抑制宫颈癌细胞免疫逃逸，为THIF应用于宫颈癌临床治疗提供依据。但机体免疫调节受多种受体-配体信号支配，是一个复杂过程，本研究仅在体外细胞培养水平进行基础研究，证据尚不充分，将进一步采用动物实验联合临床研究研究THIF 治疗宫颈癌的效果及作用机制。