贵 鹏 李朝旭 韩 莎 王胜涛 刘继鸿 陈明洲

（桂林医学院南溪山医院，桂林 541003）

骨肉瘤是骨骼中最常见肉瘤，恶性程度高，主要影响儿童和青少年，但其发病原因及分子机制尚未阐明。尽管采用手术、新辅助化疗等治疗方案，非转移性骨肉瘤患者预后及生存率显著提高，但仍有约1/3 患者出现局部复发，其中转移患者复发率高达1/4［1］。

miRNA 是一类具有高度保守性、时序性和特异性的非编码小分子RNA，长度为22～25 个核苷酸，miRNA 通过与靶基因3'非翻译区（3'UTR）不完全互补配对识别干预靶基因翻译过程［2］。

RAC1、PAK1 在多个组织中表达，具有重要细胞功能，如细胞运动、细胞生存、细胞周期、血管生成、基因转录调节及肿瘤发生发展及侵袭转移［3-4］。PAK1 为RAC1 通路中RAC1 蛋白的下游蛋白。RAC1 可促进PAK1 蛋白活化，进一步激活下游多种信号途径，从而促进肿瘤细胞存活、增殖与迁移，抑制其凋亡，调节细胞骨架动力学和细胞黏附等活动［5］。

miRNA 家族重要成员miR-182在肿瘤发展过程中至关重要。研究表明，miR-182 在多种肿瘤中，如肺腺癌、乳腺癌和胃肠道肿瘤中可作为抑癌基因抑制肿瘤细胞生长［6-8］。但miR-182 是否能够通过RAC1 通路抑制骨肉瘤生长尚无相关报道，因此，本研究通过检测miR-182在成骨细胞及骨肉瘤中的表达差异，观察miR-182 对RAC1 通路蛋白的调控作用，从而明确miR-182 对骨肉瘤HOS 细胞增殖的影响，为骨肉瘤早期诊断、基因治疗提供新的思路，为临床治疗提供理论及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 人骨肉瘤HOS 细胞购于中国科学院上海生物科学院细胞资源中心。

1.1.2 试剂 DMEN 培养基和胎牛血清购于美国Gibco 公司；CCK-8 试剂盒购于日本同人化学研究所；RAC1、PAK1 抗体购于美国Abcam 公司；Lipofectamine3000购于美国Lifecore公司；PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司；miR-182 mimic、miR-182 inhibitor、miR-182 NC购于苏州GenePharma公司。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-182 在骨肉瘤中的表达预测 采用TargetScan（www.targetscan.org）及MiRDB（www.mirdb.org）数据库寻找RAC1蛋白的mRNA序列，预测能够调控RAC1蛋白的潜在miRNA序列及其靶点。

1.2.2 细胞培养 配制骨肉瘤HOS 细胞培养基（DMEM+10%FBS+1%青-链霉素混合液）；当细胞生长至70%～80%融合时进行传代，置于37℃、5%CO2培养，传至第三代备用。

1.2.3 细胞转染 选取对数生长期骨肉瘤HOS 细胞进行miRNA 转染。将miR-mimic、miR-inhibitor 和miRNA NC 相关试剂分别与无血清培养基充分混匀，将Lipofectamine3000 加至无血清培养基中充分混匀，将溶解miRNA 制剂的溶液同溶解转染试剂的溶液混合后进行细胞共培养，培养6 h 后更换为新鲜的完全培养基，继续培养用于后续实验。

1.2.4 qPCR 检测miRNA-182 表达 按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit 试剂盒说明制备PCR 反应液，按照ABI 7500 PCR 仪使用方法进行qPCR 反应，计算各组ΔCt 值。相关miRNA 正义链及反义链由上海吉玛公司设计，miR-182 F：5'-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3'；miR-182 R：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；U6 R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。按照PrimeScript RT试剂盒说明制备RT反应液（所有操作冰上进行）：5×PrimeScript Buffer 2 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ0.5 μl，miRNA primer 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，加RNase Free ddH2O 至10 μl。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit试剂盒说明制备PCR 反应液（所有操作冰上进行）：2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μl，miR-182 forward primer（10 μmol/L）0.4 μl，miR-182 reverse primer（10 μmol/L）0.4 μl，RT 反应液（cDNA）2 μl，ddH2O 7.2 μl。

1.2.5 CCK-8法检测细胞抑制率 分别设置HOS组、miR-182 NC 组、miR-182 mimic 组，每组设6 个复孔，取对数生长期细胞，在96 孔板中均匀接种细胞悬液，37℃、5%CO2孵育24 h、48 h。加入CCK-8试剂继续孵育2 h。将96 孔板置于酶标仪中检测吸光度，重复3次，计算细胞抑制率。

1.2.6 Western blot 实验 提取各组总蛋白进行蛋白定量。80 V 恒压电泳30 min，待分离胶和浓缩胶分离后，调整至120 V 恒压电泳90 min，置于转膜槽中转膜（200 mA，2 h），牛奶封闭2 h，蛋白条带放入相应山羊抗兔一抗中4℃孵育过夜，次日取出PVDF膜，放入相应二抗中孵育1 h，系统发光成像，计算目的蛋白RAC1、PAK1表达。

1.2.7 细胞处理及凋亡检测 按照上述方法培养细胞及设置分组，培养24 h，消化，收集细胞；按照细胞凋亡试剂盒说明操作，流式细胞仪检测。

1.2.8 细胞处理及周期检测 按照上述方法培养细胞及设置分组，培养24 h，消化，收集细胞，预冷乙醇过夜固定，次日染色，流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0 软件进行统计学分析，计量资料以表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Targetscan 及miRDB 数据库筛选可能靶向RAC1 的miRNA 序列 通过TargetScan 及MiRDB 数据库筛选可能靶向RAC1 的miRNA 的基因序列包含：miR-182、miR-96、miR-101、miR-142、miR-20、miR-365、miR-137（图1）。miR-182 可能通过RAC1蛋白影响骨肉瘤HOS细胞生长。

图1 生信网络预测miR-182和RAC1表达Fig.1 Bioinformatics Network predicts expressions of miR-182 and RAC1

2.2 qPCR 检测骨肉瘤HOS 细胞miR-182 表达qPCR 验证各组细胞中miR-182 表达，结果显示，与未转染对照骨肉瘤HOS 细胞（2.02±0.11）相比，miR-182 NC 转染组（阴性对照组）miR-182 表达（2.08±0.20）差异无统计学意义，miR-182 inhibitor转染组miR-182 表达（0.65±0.32）显著降低（P＜0.01），miR-182 mimic 转染组miR-182 表达（2.81±0.15）显著升高（P＜0.01，图2）。

图2 各组骨肉瘤HOS细胞中miR-182表达Fig.2 miR-182 expression in osteosarcoma HOS cells of each group

2.3 CCK-8检测细胞增殖 CCK-8测定24 h、48 h、72 h 各组细胞OD 值，结果显示，miR-182 NC 转染组骨肉瘤HOS 细胞抑制率差异无统计学意义（图3），miR-182 mimic 转染组细胞抑制率分别为（34.12±0.20）%、（20.18±0.16）%、（8.25±16.00）%，显著降低，标准曲线见图4。

图3 各组骨肉瘤HOS细胞OD值Fig.3 OD values of osteosarcoma HOS cells in each group

图4 各组不同时期细胞浓度Fig.4 Cell concentration in different periods of each group

2.4 Western blot 检测RAC1、PAK1 蛋白表达Western blot 验证各组细胞RAC1、PAK1 蛋白表达，结果显示，miR-182 NC转染组细胞RAC1及PAK1蛋白表达与未转染HOS 组差异无统计学意义（P＞0.05），与miR-182 mimic 转染组细胞RAC1 及PAK1蛋白表达差异具有统计学意义（P＜0.01，图5）。

图5 各组骨肉瘤HOS细胞RAC1、PAK1蛋白表达Fig.5 Expressions of protein RAC1 and PAK1 proteins in osteosarcoma HOS cells of each group

2.5 流式细胞术检测骨肉瘤HOS 细胞凋亡 流式细胞术检测HOS 组、miR-182 NC 转染组、miR-182 mimic 转染组细胞凋亡率，结果显示，miR-182 NC 转染组［（4.93±0.51）%］与未转染骨肉瘤HOS 细胞组［（5.58±0.42）%］细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），miR-182 mimic 转染组［（22.66±0.42）%］细胞凋亡率显著提高（P＜0.01，图6）。

图6 流式细胞术检测各组骨肉瘤HOS细胞凋亡Fig.6 Flow cytometry to detect apoptosis of osteosarcoma HOS cells in each group

2.6 流式细胞术检测骨肉瘤HOS 细胞周期 流式细胞术检测未转染HOS 组、miR-182 NC 转染组、miR-182 mimic转染组细胞周期，结果显示，miR-182 mimic 组HOS 细胞G1 期占比［（55.26±0.72）%］与HOS 组及miR-182 NC 转染组差异显著（P＜0.01），S 期占比［（27.37±0.38）%］明显下降（P＜0.01），G2期占比［（16.96±0.83）%］有所下降（P＜0.05，图7）。

图7 流式细胞术检测各组骨肉瘤HOS细胞周期Fig.7 Flow cytometry detection of cell cycle of osteosarcoma HOS cells in each group

3 讨论

目前骨肉瘤具体发病机制尚不明确，尚无有效治疗方案。近年miRNA 在肿瘤中的研究取得重要进展，为肿瘤早期诊断、早期治疗、化疗耐药、远处转移及改善预后等提供了新的思路，但miRNA 在骨肉瘤诊断治疗等方面涉及较少，本研究通过探讨miRNA 与骨肉瘤细胞的相关性及体外试验，为揭示骨肉瘤发病机制、基因靶向治疗提供实验及理论基础。

miRNA 相关拮抗药物或基因模拟药物已被设计用于癌症治疗。单个miRNA 同时靶向多个信号通路得到广泛认同，为难治性癌症治疗提供了新的方案。

RAC1 信号传导与多种肿瘤细胞生物过程相关，作为一种小的GTP 酶，通过调节RAC1能够使肿瘤细胞切换活跃状态和非活跃状态。RAC1 激活后，与一系列效应子相互作用，介导肿瘤细胞多种生物学功能［9］。已有实验证实PAK1 在多个致癌信号通路中的核心作用，其能够调节肿瘤细胞的可辨识度，并降解肿瘤细胞防御能力，因此作为潜在的肿瘤细胞治疗靶标引起广泛关注［10］。BU 等［11］发现PAK1 信号传导是RAC1 在血管生成中的关键下游介质，抑制RAC1和PAK1蛋白表达可降低肿瘤细胞血管生成能力。同样，XIA 等［12］研究发现，抑制RAC1 或PAK1 可损伤癌细胞血管生成诱导能力。对小G 蛋白的研究也逐渐成为肿瘤研究的主要领域。

本研究发现，构建过表达miR-182 的细胞可有效抑制PAK1、RAC1蛋白活性，由此推测miR-182表达可介导GTP 酶活化，抑制骨肉瘤HOS 细胞生长，降低骨肉瘤HOS 细胞增殖能力并促进其凋亡，并抑制骨肉瘤HOS生长周期，降低S期比例，使多数细胞停滞于G1期。结合RAC1及PAK1蛋白介导的相关细胞功能，miRNA相关生物制剂或许可通过降低骨肉瘤细胞GTP 合成、骨肉瘤细胞血管生成从而降低骨肉瘤细胞活性。

通过构建miRNA 相关生物制剂可能影响骨肉瘤早期形成、远期转移及骨肉瘤耐药机制等，从基因层面出发改变肿瘤细胞蛋白功能及RNA 翻译转录过程，为精准靶向治疗骨肉瘤开辟新的领域。