陈思勤 曾普华 张 振 马思静 袁 坤 何凤姣

（湖南省中医药研究院附属医院肿瘤科，长沙 410006）

肺癌是导致癌症相关死亡的首要原因，我国肺癌发病率和病死率也呈持续上升趋势［1］。尽管肺癌治疗手段不断改进，但晚期转移仍是预后不良的主要原因。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是导致肿瘤转移和侵袭的主要病理机制，但诱导EMT 起始及进展的调控机制尚未明确［2-3］。近年研究发现，外泌体是肿瘤细胞间信息交流的重要途径，通过自分泌包裹microRNA（miRNA）等活性成分的外泌体可促进EMT 发生，增强肿瘤细胞迁移和侵袭能力［4-5］。固肺消积饮是我科治疗肺癌常用方剂，已在临床研究中证实具有缓解症状、增强化疗效果、降低副作用等功效，但其作用机制仍无相关报道［6-8］。本文拟从外泌体角度探讨固肺消积饮对肺癌A549细胞的作用机制，并结合文献报道和前期预实验结果选取1个外泌体中差异性表达miRNA，即microRNA-186-5p（miR-186-5p），深入研究外泌体中的活性成分［9-11］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级健康雌性Wistar 大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体重180～220 g。

1.1.2 主要试剂与仪器 肺癌A549 细胞（中国科学院上海细胞库）；胎牛血清（美国SBI 公司）；RPMI1640 培养基（美国Hyclone 公司）；LipofectamineTM转染试剂、Total Exosome Isolation 试剂盒（美国Invitrogen公司）；BCA蛋白定量试剂盒、DAPI、RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit（美国Sigma 公司）；Phalloidin（美国Life Technologies 公司）；CD63、TSG101、Calnexin、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GAPDH一抗（英国Abcam公司）；Transwell小室（美国Corning 公司）；Matrigel 基质胶（美国BD Bioscience公司）；JEM-1400透射电镜（日本电子株式会社）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 将肺癌A549细胞常规培养于含10%无外泌体胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2培养。将miR-186-5p NC、miR-186-5p inhibitor（上海吉玛制药技术有限公司设计合成）转染至A549 细胞，按照LipofectamineTM转染试剂说明书操作。

1.2.2 固肺消积饮含药血清制备 40只Wistar大鼠灌胃给予固肺消积饮（本院中药房提供，20 g/kg），2 次/d，连续7 d，第7 天第1 次灌胃后2 h 行腹主动脉采血，无菌条件下分离血清，4℃、100 000 r/min离心70 min，取上清，去除外泌体沉淀，56℃灭活30 min，0.22 μm 滤器过滤除菌，-70℃保存备用，即获得固肺消积饮含药血清［12］。采用等体积生理盐水灌胃作为对照，获得无药血清。

1.2.3 外泌体分离与收集 无药血清（10%）诱导A549细胞48 h，取上清，获得的外泌体记为NC-Exo。固肺消积饮含药血清（10%）诱导A549 细胞48 h，取上清，分离的外泌体记为XJD-Exo。固肺消积饮含药血清（10%）诱导转染miR-186-5p NC的A549细胞48 h，取上清，分离的外泌体记为XJD-miR-186-5p NC-Exo。固肺消积饮含药血清（10%）诱导转染miR-186-5p inhibitor的A549细胞48 h，取上清，分离的外泌体记为XJD-miR-186-5p inhibitor-Exo。按照Total Exosome Isolation 试剂盒说明书进行外泌体抽提：收集上清，5 000 r/min 离心20 min，收集上层无细胞碎片的上清，加入1/2体积的外泌体提取试剂，混匀，4℃孵育过夜，次日4℃、12 000 r/min 离心60 min，弃上清，加入适量PBS 重悬外泌体沉淀，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。

1.2.4 外泌体鉴定

1.2.4.1 透射电镜观察外泌体形态 取20 μl外泌体悬液至2 mm 载样铜网，室温静置5 min，滤纸吸干多余液体，滴加20 μl 3%磷钨酸，室温复染5 min，滤纸吸干多余液体，65℃白钨灯烘烤15 min，120 kV JEM-1400透射电镜下观察外泌体形态并拍照。

1.2.4.2 Western blot 检 测CD63、TSG101 和Calnexin 表达 取20 μg外泌体悬液，常规进行Western blot 实验，一抗孵育浓度分别为：CD63（1∶500）、TSG101（1∶1 000）、Calnexin（1∶1 000）。

1.2.5 荧光标记法检测A549 细胞摄取外泌体情况 将A549细胞接种于共聚焦培养皿，贴壁后加入PKH67 标记的外泌体（2 μg），采用PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit 进行标记，常规培养48 h，PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗涤，1%Triton 透化10 min，PBS 洗涤，1%牛血清白蛋白封闭30 min，PBS 洗涤，DAPI 避光染色6 min，PBS 洗涤，Phalloidin 避光染色30 min，PBS 洗涤，荧光显微镜下观察拍照。

1.2.6 RT-qPCR 检测外泌体中miR-186-5p 表达引物序列：miR-186-5p F：5'-ACACTCCAGCTGGGCAGCAGCACACT-3'，R：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物合成于苏州金唯智生物科技有限公司。

1.2.7 实验分组 实验分为：A 组（A549 细胞+PBS）、B 组（A549 细胞+NC-Exo）、C 组（A549 细胞+XJD-Exo）、D 组（A549 细胞+XJD-miR-186-5p NCExo）、E 组（A549 细胞+XJD-miR-186-5p inhibitor-Exo）。将A549 细胞接种于6 孔板，随机分为5 组，B、C、D、E 组分别取上述4 种外泌体（100 μg/ml）与A549细胞共培养48 h，A组加等体积PBS作为对照。

1.2.8 Transwell 实验检测各组细胞迁移和侵袭迁移实验：共培养48 h，弃培养液，PBS 清洗2 次，胰酶消化获得细胞，不含血清的1640培养基重悬细胞，将含有6×104个细胞的200 μl悬液加入Transwell上室，下室加入600 μl 含20%胎牛血清的培养基，继续培养24 h。取出小室，多聚甲醛固定，结晶紫染色，光学显微镜下拍照并计算细胞数。侵袭实验：Transwell 上室底部铺20 μl Matrigel 基质胶，其余步骤参照迁移实验。

1.2.9 Western blot检测EMT相关蛋白表达 共培养48 h，收集A549细胞，加入RIPA 裂解液充分裂解细胞，离心，取上清，BCA 蛋白定量。取40 μg 总蛋白，常规进行Western blot 实验，一抗孵育浓度分别为：E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶1 000）、vimentin（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0 或Graphpad prism 6.0 软件分析数据。计量数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体鉴定 透射电镜下观察到外泌体呈典型圆形或椭圆形囊泡状，分散或聚集性分布。Western blot 结果显示，与A549 细胞相比，外泌体高表达表面分子标志物CD63 和TSG101，低表达内质网标志蛋白Calnexin（图1）。

图1 外泌体鉴定Fig.1 Identification of exosomes

2.2 外泌体摄取 PKH67 标记的外泌体与A549细胞共培养48 h，荧光显微镜下观察到标记为绿色荧光的外泌体主要分布于A549细胞胞浆内（图2）。

图2 荧光标记法检测A549细胞摄取外泌体情况（×400）Fig.2 Uptake of exosomes by A549 cells detected by fluorescence labeling（×400）

2.3 外泌体中miR-186-5p 表达 共分离得到4 种外泌体，即NC-Exo、XJD-Exo、XJD-miR-186-5p NCExo、XJD-miR-186-5p inhibitor-Exo，qRT-PCR 检测结果显示，各外泌体中miR-186-5p 表达水平分别为（1.00±0.14）、（4.69±0.53）、（4.52±0.64）、（0.87±0.31），差异有统计学意义（F=267.800，P＜0.001，n=12）。NC-Exo、XJD-miR-186-5p inhibitor-Exo 中miR-186-5p表达水平低于XJD-Exo、XJD-miR-186-5p NC-Exo，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 各组细胞迁移和侵袭能力 Transwell 结果显示，各组间迁移和侵袭能力差异均有统计学意义（F=171.200，P＜0.001；F=168.300，P＜0.001）。A、C、D组迁移、侵袭能力低于B、E 组，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3 Transwell检测各组细胞迁移和侵袭（×100）Fig.3 Transwell test to detect cell migration and invasion（×100）

2.5 各组细胞EMT相关蛋白表达 Western blot结果显示，各组间E-cadherin、N-cadherin、vimentin 表达差异均有统计学差异（F=35.470，P＜0.001；F=149.100，P＜0.001；F=413.300，P＜0.001）。A、C、D组E-cadherin 表达高于B、E 组，N-cadherin、vimentin 表达低于B、E组，差异具有统计学差异（P＜0.05，图4）。

图4 Western blot检测EMT相关蛋白表达Fig.4 Expressions of EMT related proteins detected by Western blot

3 讨论

与放化疗等现代医学手段相比，中医药具有毒副作用小、耐药性低、生活质量好等优势，且多活性组分配伍复方可能通过多种作用靶点发挥更好的治疗效应，因此近年中医药在肿瘤治疗中逐渐得到重视。我院蒋益兰教授提出肺癌转移原因可能在于“虚、瘀、痰、毒”，并基于该理论基础将固肺消积饮作为我科治疗肺癌的基本方剂。固肺消积饮由益气化瘀解毒方发展而来，包含人参、补骨脂、黄芪、莪术等多种中草药，具有清热解毒、益气祛痰、化瘀散结等功效，在临床应用中获得了较好疗效。贺佐梅等［6］通过TCMSP 数据库筛选、基因富集分析等网络药理学分析方法发现，固肺消积饮可能参与调控PI3K/AKT 及钙离子信号通路。但关于固肺消积饮治疗机制却鲜有报道，理论研究严重滞后，本文旨在进一步探讨其治疗机制。

外泌体是一种脂质双层膜结构的圆形或椭圆形微小囊泡，直径约30～100 nm，可由大多数细胞通过内吞、融合、外排等一系列复杂过程主动向外分泌，用于细胞间信息传递与物质运输［13-14］。大量研究表明，异常的细胞间通讯是肿瘤发生发展的重要原因，外泌体则起关键信使作用，该效应不仅存在于肿瘤实质细胞与免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等支持细胞间，还大量存在于癌细胞间，甚至通过自分泌进行自我调节［15］。近年外泌体途径成为药物研发的热门靶点，也为探索已有药物的治疗机制提供了方向［16］。因此，本研究拟通过外泌体途径寻找固肺消积饮抑制肺癌转移的突破口。

通过分离肺癌A549 细胞外泌体（NC-Exo）与A549 细胞共培养，结果显示，与A 组相比较，B 组迁移、侵袭能力及EMT 转化程度显著提高，表明A549细胞来源外泌体可促进细胞迁移和侵袭，证实外泌体自分泌途径在肺癌转移中的重要作用。为进一步探讨固肺消积饮能否通过外泌体途径发挥治疗效应，课题组制备固肺消积饮含药血清用于诱导A549 细胞获得XJD-Exo，共培养后结果显示，C 组迁移、侵袭能力及EMT 转化程度均显著低于B 组，表明固肺消积饮含药血清可通过外泌体途径抑制肺癌转移，可能与固肺消积饮对外泌体某种活性成分的调控有关。

外泌体的生物学功能主要取决于其活性成分，如Rab 蛋白、GTP 酶与细胞膜融合有关［17］；胆固醇、鞘磷脂等脂质成分可提高细胞膜稳定性［18］；肿瘤易感基因101 蛋白（TSG101）参与外泌体形成［19］。外泌体miRNA 也在肿瘤迁移和侵袭中扮演重要角色，如LI 等［20］发现，来自外泌体的miR-302b 可靶向TGFβRⅡ/ERK 信号通路，从而抑制肺癌细胞增殖和迁移。为深入挖掘外泌体中的有效成分，课题组结合文献报道和前期预实验结果选取差异表达的miR-186-5p，即固肺消积饮含药血清可显著上调外泌体中miR-186-5p 水平。通过RNA 转染技术选择性抑制miR-186-5p 表达，进而阻断固肺消积饮含药血清对外泌体miR-186-5p的促表达效应，得到XJDmiR-186-5p inhibitor-Exo。与C组相比，E组迁移、侵袭能力及EMT 转化程度均提高，但尚未达到B 组水平，表明抑制外泌体miR-186-5p 水平可部分逆转固肺消积饮的保护效应，证实固肺消积饮通过上调外泌体miR-186-5p 表达的保护机制，但该途径并不是唯一作用机制，可能还有其他途径仍需进一步研究。

综上所述，本研究认为固肺消积饮可通过上调外泌体miR-186-5p 表达抑制肺癌A549 细胞迁移和侵袭，但尚有多个方面未探讨清楚，未来可作为主要研究方向，如固肺消积饮对miR-186-5p 的调节机制、miR-186-5p具体的靶基因等。