黄娇丽，刘嘉欣，易有金*，刘汝宽，朱树清，邓后勤

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410000）（2.百色学院农业与食品工程学院，广西百色 533000）（3.湖南省林业科学院省部共建木本油料资源利用国家重点实验室，湖南长沙 410000）（4.汝城县繁华食品有限公司，湖南郴州 424100）

柑橘为芸香科柑橘亚科柑橘属植物[1]，柑橘是世界上最重要的农作物之一，全球产量超过1.4×109t。我国是柑橘主产国，柑橘产地主要集中在南方亚热带地区，柑橘的栽培面积与年产量均居世界首位[2]。柑橘属非呼吸跃变型果实，成熟后采收，采摘期集中，在贮运中易受真菌浸染而腐烂，造成严重的经济损失，阻碍柑橘产业的发展。柑橘青霉病是柑橘果实采后危害最大的病害[3-4]。目前，柑橘采后保鲜多以化学防腐保鲜剂处理为主[5-6]。其中，抑霉唑、咪鲜胺等化学防腐保鲜剂虽能适当抑制柑橘青霉病的扩散，但易使柑橘青霉菌产生抗药性，且化学试剂多有毒性和化学残留，对消费者健康带来安全隐患[7]。因此，选择低毒低污染、非化学的、抗药性程度低的植物源活性保鲜剂已成为国内外研究的热点[8]。

植物提取物主要来源为药用植物或香料植物，已有研究其对柑橘采后保鲜效果良好[9-10]。不同植物水提取物或有机溶剂提取物因其含有次生代谢产物，可以抑制柑橘的腐烂，其有效活性成分主要包括酚、醌、醛、生物碱与萜类等[11-12]。植物源保鲜剂较化学防腐保鲜剂更安全，但单一的提取物抑菌范围窄，效果一般，植物提取物之间复配或与多糖、淀粉等复配成可食性涂膜应用于果蔬保鲜，更有利于果实品质的保持。

以可食性涂膜剂为成膜基质，植物提取物为抑菌剂，实现优势互补制备植物提取物复合涂膜剂已成为果蔬保鲜领域研究热点。本文主要以鱼腥草、广藿香、丁香、厚朴、蛇床子5 种中草药作为试验材料，通过平板抑菌试验初步筛选出对柑橘青霉菌抑菌效果较好的中草药，并测定其最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），研究鱼腥草丁香普鲁兰多糖复配保鲜剂对柑橘的保鲜效果，旨在为寻找安全、高效的植物源柑橘保鲜剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼腥草、广藿香、丁香、厚朴、蛇床子，购于湖南农业大学千金大药房；柑橘，于长沙当地果园采摘；咪鲜胺，江苏剑牌农化股份有限公司。

柑橘青霉菌（Penicillium italicum），由湖南农业大学食品科学技术学院微生物实验室提供。

1.2 仪器与设备

智能人工气候箱（GZ-400-GSII），韶关市广智科技设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 柑橘青霉菌致病性检测

菌种活化：将湖南农业大学食品科学技术学院微生物实验室提供的柑橘青霉菌接种至PDA 培养基中，置于28±1 ℃培养箱中培养，经活化后备用。

柑橘青霉菌孢子悬浮液的制备：将柑橘青霉菌菌丝接种于PDA 培养基上，28±1 ℃培养7 d，加入10 mL带有玻璃珠PDB 培养液，洗下柑橘青霉菌孢子到无菌锥形瓶中，摇匀，使孢子悬浮液终浓度为1×106CFU/mL，4 ℃保存备用。

挑选无病害无创伤的柑橘果实为试材，用无菌针头在柑橘赤道部位刺两个2 mm 深，2 mm 宽的伤口，每个伤口接种10 μL 终浓度1×106CFU/mL 的孢子悬浮液，将柑橘置于保鲜袋内，28±1 ℃条件下贮藏。处理30 个果实，逐日观察发病状态。

1.3.2 不同中草药水提液抑菌率测定

中草药水提液制备[13]：分别将丁香、厚朴、鱼腥草、广藿香、蛇床子5 种中草药进行粉碎，过40 目筛，称取120 g 于1000 mL 烧杯中，加入500 mL 无菌水，先100 ℃煮沸10 min，再90 ℃熬制15 min，后75 ℃水浴120 min，无菌纱布过滤取滤液，10000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，将上清液浓缩至80 mL，定容至100 mL。即得浓度为1.20 g/mL（中草药粉末质量与水提液定容体积比）的中草药水提液，4 ℃密封保存备用。按照植物源活性成分与培养基1:9（0.84 mL 1.3.2 水提液+15 mL 培养基）的比例，将配制好的5种中草药水提液分别加入PDA 培养基中配成带药培养基（浓度为0.60 mg/mL），混匀，倒入培养皿，静置凝固。将分离纯化的柑橘青霉菌进行活化。采用菌丝生长速率法[14]，从柑橘青霉菌菌落边缘上取直径5 mm 的菌块置于平板中央，带菌丝的一面向下，以无菌水为空白对照，每个处理重复3 次，28±1 ℃下培养7 d。用十字交叉法测各组菌落直径并计算抑菌直径、抑菌率[15]。

1.3.3 不同中草药水提液MIC 测定

采用二倍稀释法[16]，根据1.3.2 中5 种中草药水提液对柑橘青霉菌抑菌效果，筛选出抑菌效果较好的中草药水提液进行梯度稀释（1.20、0.60、0.30、0.15 g/mL），并按1.3.2 方法制成带药培养基，将柑橘青霉菌接种于各带药培养基中心，28±1 ℃培养48 h，以无菌生长的培养皿的含药浓度为MIC。每个处理重复3 次。

1.3.4 不同中草药水提液对柑橘青霉菌孢子萌发的影响

根据1.3.2 试验结果筛选出的抑菌效果较佳的中草药水提液，采用二倍稀释法将中草药水提液分别稀释成五个浓度（1.20、0.60、0.30、0.15、0.075 mg/mL）。取50 μL 终浓度1×106CFU/mL 孢子悬浮液与50 μL上述不同浓度中草药水提液分别混匀于凹玻片上（鱼腥草丁香复合体积比例为1:1，总中药水提液体积为50 μL），28±1 ℃保湿培养24 h。无菌水为空白对照组，每个处理重复3 次。观察孢子萌发，计算孢子萌发抑制率[17]，将孢子萌发抑制率换算成机率值（y），将中草药水提液浓度换算成对数值（x），根据机率值和对数值用回归法得到毒力回归方程（y=ax+b），最终求得EC50和EC90。孢子萌发抑制率计算方法如下：

1.3.5 鱼腥草丁香普鲁兰多糖复配保鲜剂制备

称取7.5 g 普鲁兰多糖粉末于1000 mL 烧杯中，加450 mL 无菌水，65 ℃水浴1 h，充分搅拌溶解。待其完全溶解后，分别加入1.00 mL鱼腥草水提液和0.50 mL 丁香水提液，搅拌均匀后定容至500 mL 备用，即得鱼腥草丁香普鲁兰多糖复配保鲜剂（1.20 mg/mL 鱼腥草+0.60 mg/mL 丁香+1.5%普鲁兰多糖）。

1.3.6 复配保鲜剂对柑橘采后青霉菌抑制作用研究

柑橘果实用体积分数75%乙醇擦洗后，无菌水冲洗，待果实表面水分自然风干后，用直径2 mm 无菌针头在各组柑橘赤道表面刺两个2 mm 深、2 mm 宽伤口，以先于无菌水中浸泡1 min 后于伤口接种10 μL青霉孢子悬浮液为阴性对照组CK，以先于0.225 g/L咪鲜胺溶液中浸泡1 min 后于伤口接种10 μL 青霉孢子悬浮液为阳性对照组，以先于鱼腥草丁香普鲁兰多糖复配保鲜剂中浸泡1 min 后于伤口接种10 μL 青霉孢子悬浮液为保鲜剂组，接种后置于28±1 ℃、相对湿度75%条件下贮藏，每隔3 d 测定果肉各项指标，每组15 个果实，3 组平行。

1.3.7 果实生理相关指标的测定

发病率测定方法：采用计数法，按照公式（4）计算果实发病率。

失重率测定方法：采用称重法，按照公式（5）计算果实的失重率。

参照曹建康[18]的方法，采用静置法测定呼吸强度，手持折光仪测定可溶性固形物，2,6-二氯酚靛酚法测定抗坏血酸含量，氢氧化钠溶液滴定法测定可滴定酸含量。

1.4 数据处理

数据采用Origin 2019 软件作图，数据采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，采用Duncan 多重比较进行显著性分析，p＜0.05 表示组间差异显著。

2 结果与讨论

2.1 柑橘青霉菌致病力检测

柑橘贮藏2 d，开始有发病迹象，柑橘创伤口表现水浸渍状，出现白色霉层，不整齐圆形生长，粉末状；贮藏3 d 柑橘创伤口处中央开始出现青色的霉层，呈不规则圆形扩展，发病到全果腐烂需要12 d，有浓重青霉味。

2.2 不同中草药水提液的抑菌活性筛选结果

2.2.1 不同中草药水提液抑菌作用

5 种中草药水提液对柑橘青霉菌有不同程度的抑菌活性（如表1）。其中丁香和鱼腥草对柑橘青霉菌的抑菌效果最佳，平均抑菌圈直径分别达24.52 mm 和16.28 mm；抑菌率分别为73.45%和49.85%。其次是厚朴，抑菌圈直径为6.34 mm，抑菌率为19.38%。而广藿香和蛇床子水提液处理对柑橘青霉菌的抑菌效果不佳。因此初步筛选出丁香和鱼腥草作为试验材料进行MIC 测定。

表1 不同中草药水提液对柑橘青霉菌的抑制作用(浓度0.60 mg/mL)Table 1 Inhibition effect of Penicillium italicum in different herbal extracts (0.60 mg/mL)

2.2.2 鱼腥草和丁香水提液MIC 测定

试验结果显示，丁香水提液浓度大于或等于0.60 mg/mL 时，完全抑制柑橘青霉菌生长；鱼腥草水提液浓度为1.20 mg/mL 时，几乎完全抑制柑橘青霉菌生长。因此丁香、鱼腥草水提液MIC 分别为0.60 mg/mL和1.20 mg/mL。

2.3 鱼腥草和丁香水提液对柑橘青霉菌孢子萌发影响

鱼腥草和丁香水提液对柑橘青霉菌孢子萌发的抑制作用见表2 所示。在相同处理时间内，柑橘青霉菌孢子对两种中草药提取液的敏感度不同。柑橘青霉菌孢子对丁香水提液的敏感性较鱼腥草水提液强，丁香和鱼腥草两者水提液复合使用对青霉菌孢子萌发抑制效果最佳。丁香水提液主要成分可能是丁香酚，丁香酚具有较强的抗真菌活性，通过破坏菌体细胞壁和细胞膜，改变细胞膜完整性和通透性，干扰菌体生长代谢起抑菌的效果[19]。天然化合物之间存在协同效应，不同植物提取物复配比单一使用效果更佳[20-21]。这种协同作用的机理可能是通过增强菌体细胞膜透性，促进其他活性物质渗透入菌体，增加有效浓度累积，造成细胞膜的破裂，导致菌体死亡[22]。综上所述，丁香和鱼腥草水及其复合水提液在一定范围内能有效抑制柑橘青霉菌的孢子萌发。

表2 丁香和鱼腥草水提液对柑橘青霉菌孢子萌发的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of Syzygium aromaticum and Houttuynia cordata extract on spore germination of Penicillium italicum

2.4 鱼腥草丁香普鲁兰多糖复配保鲜剂对柑橘采后青霉菌抑制效果的影响

2.4.1 复配保鲜剂对柑橘失重率和发病率的影响

由图1a 所示，当柑橘损伤接种青霉菌时，在整个贮藏过程中，所有处理组柑橘失重率随贮藏时间的延长而增加，保鲜剂组与对照组CK 的失重率无显著差异（p＞0.05），阳性对照组在整个贮藏过程中失重率最低，且与其他处理组差异显著（p＜0.05）。果蔬在采收后由于蒸腾和呼吸过程往往会失水减重[23]，而保鲜剂组处理的柑橘对阻止柑橘贮藏过程中的失重效果不明显，该结果与Hadar 等[24]的研究结果类似，可能是由于以多糖为基础的可食性涂层不能形成有效的水蒸气屏障[25]。可见，保鲜剂组处理的柑橘不能有效降低柑橘贮藏过程中的失重率。

图1 复配保鲜剂对柑橘失重率(a)和发病率(b)的影响Fig.1 Effect of composite coating on weight loss rate (a) and incidence rate (b) in Citrus reticulata

由图1b 所示，贮藏至第3 d，对照组（CK）发病率分别达58.34%和55.56%，而阳性对照组和保鲜剂组均未发病；当贮藏至第6 d 时，对照组发病率达100%，保鲜剂组和阳性对照组发病率无显著差异（p＞0.05），分别为25.00%和33.33%；当贮藏至第9 d时，保鲜剂组虽发病率为83.33%，但与CK 相比，发病率降低了16.67%。与CK 相比（柑橘的发病率在贮藏第3 d 出现），保鲜剂组处理的柑橘果实发病率延迟到第6 d。鱼腥草丁香普鲁兰多糖复合涂膜保鲜剂组能提高果实采后的抗病性，控制青霉病的发病率。

综上所述，保鲜剂处理组不能有效降低柑橘贮藏过程中的失重率，但可有效抑制柑橘的发病率。

2.4.2 复配保鲜剂对柑橘营养品质的影响

由图2a 所示，总体上各处理组柑橘在整个贮藏过程中，可溶性固形物含量呈上升趋势，而保鲜剂组柑橘的可溶性固形物含量在各组中最低，贮藏至第6 d，保鲜剂组可溶性固形物均显著低于其它各处理组（p＜0.05）。可能是由于感染柑橘青霉菌的果实开始腐烂，果实细胞壁中的原果胶转化为可溶性糖[26]。同时，随着贮藏时间的延长，果实中的水分逐渐散失，导致可溶性固形物含量增加。保鲜剂组处理推迟了贮藏期间可溶性固形物含量的增加，可能是由于延迟了果实成熟和衰老过程。

由图2b 所示，随着贮藏时间的延长，各组柑橘果实的可滴定酸含量呈现上升趋势，阳性对照组柑橘果实的可滴定酸含量始终最低。贮藏至第6 和第9 d，保鲜剂组的可滴定酸含量显著低于CK 组（p＜0.05）。可滴定酸主要是果实中的有机酸，一般果实在发育完成时可滴定酸含量最高，随着果实的成熟与衰老，其含量逐渐下降。而本实验中，可滴定酸含量随着贮藏时间增加而上升，原因可能是由于果实的呼吸作用和柑橘青霉菌分解作用而产酸导致[27]。

由图2c 所示，在贮藏过程中，CK 组的Vc 含量一直呈现上升趋势，而保鲜剂组和阳性对照组的Vc含量呈现先上升后下降的趋势，阳性对照组和保鲜剂组Vc 含量在整个贮藏过程中的变化相对于CK 组较小。Vc 是柑橘果实中重要的营养品质之一。在本实验中，柑橘经损伤接种青霉菌后贮藏，随着贮藏时间的延长Vc 含量逐渐上升，原因可能是接种青霉菌后的柑橘，在贮藏过程中，果实发病腐烂，破坏细胞壁的完整性，从而导致细胞壁释放D-半乳糖醛酸[28]，促进Vc 的合成，从而呈现Vc 含量上升的现象，而保鲜剂处理组可以在柑橘贮藏过程中保持果实细胞壁的完整性，从而影响Vc 的合成。该结果与Gao[29]研究结果一致。因此可以推测鱼腥草丁香复配保鲜剂可抑制沙糖橘因青霉病引起的腐烂，延缓其衰老，延长果实保鲜期。

图2 复配保鲜剂对柑橘营养品质的影响Fig.2 Effect of composite coating on nutritional quality of Citrus reticulata

2.4.3 复配保鲜剂对柑橘呼吸强度的影响

由图3 可知，柑橘在贮藏6 d 过程中，各组果实的呼吸强度一直上升，阳性对照组柑橘果实呼吸强度在整个贮藏过程中始终最低，其次是保鲜剂组。贮藏至第3 d 和第6 d，保鲜剂组柑橘果实呼吸强度显著低于CK 组（p＜0.05），贮藏至第6 d 时，保鲜剂柑橘果实的呼吸强度比CK 组低46.54%。结果表明，保鲜剂组较CK 组可有效延缓果实呼吸强度的升高。柑橘果实在贮藏过程中呼吸强度上升，原因可能是柑橘果实在损伤接种青霉菌后，为抑制青霉菌的感染，其果实组织通过加强呼吸来抵御伤害，呼吸强度越高，说明果实感染青霉菌的程度越深，该结果与Aghdam[30]研究结果基本相符。

图3 复配保鲜剂对柑橘呼吸强度的影响Fig.3 Effect of composite coating on respiration intensity in Citrus reticulata

3 结论

本实验研究了丁香、厚朴、鱼腥草、广藿香、蛇床子5 种中草药水提液对柑橘青霉的抑菌活性。初步结果表明，丁香和鱼腥草水提液对柑橘青霉菌菌丝生长表现较强的抑制活性，同时可有效抑制柑橘青霉菌孢子的萌发。鱼腥草丁香普鲁兰多糖复合涂膜保鲜剂（1.20 mg/mL 鱼腥草+0.60 mg/mL 丁香+1.50%普鲁兰多糖）处理柑橘能提高果实采后的抗病性，控制青霉病的发病率，保持果实的营养品质，延长果实保鲜期。