黄亚东，张 翔，陶书中，陈正东

(1.江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223005；2.江苏省食品微生物工程实验室，江苏 淮安 223005；3.江苏毕豪食品有限公司，江苏 涟水 223400)

硒是一种重要的微量元素。天然食品中的硒含量普遍较低，不能满足人体对硒的需求。因此，开发富硒食品的前景十分广阔。酱油作为家庭必备的调味品之一，是人们摄入有益活性物质的重要途径。黑豆因其活性物质含量高于黄豆，逐渐成为酱油改良的主要原料。本研究结合酱油生产工艺探索符合生产实际的微生物富硒条件，以优化黑豆酱油富硒技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

米曲霉(沪酿3.042)：江苏毕豪食品有限公司。

1.1.2 培养基

察氏培养基：NaNO33 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蔗糖30 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂20 g，pH自然，纯水定容至1000 mL，121 ℃灭菌30 min。

加硒豆芽汁培养基：将黄豆芽30 g于500 mL纯水中蒸煮过滤，加入可溶性淀粉20 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、(NH4)2SO40.5 g，pH值6.8左右，添加亚硒酸钠至所需浓度，加水定容至1000 mL，121 ℃灭菌30 min。

1.1.3 试剂

NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、蔗糖、FeSO4·7H2O、HCl、琼脂：均为分析纯；环己烷(C6H12)：色谱纯；2,3-二氨基萘(DAN)；乙二胺四乙酸二钠。

1.2 方法

1.2.1 富硒米曲霉菌种复壮

将冷冻保藏的菌种接入察氏培养基，37 ℃条件下培养3 d，获得长势良好的米曲霉菌体。传代培养三次，使其活性最高，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 米曲霉菌种液制备

从培养基上刮取一环孢子，接种到豆芽汁培养基中，恒温摇床培养(180 r/min、37 ℃)48 h，装液量100 mL/250 mL。

1.2.3 米曲霉培养条件

接种量10%，恒温摇床培养(180 r/min、37 ℃)，装液量100 mL/250 mL。

1.2.4 生物量测定

取米曲霉培养液，纱布过滤，蒸馏水洗涤3次，离心5 min，烘干称重，以菌体干重作为米曲霉的生物量。

1.2.5 硒含量测定

参照GB 5009.93—2017，采用荧光分光光度法测定硒含量。

1.2.6 米曲霉生长曲线

设置4组实验，亚硒酸钠浓度分别为0、50、75、100 mg/L，按1.2.3条件培养，每12 h取样测定生物量。每组实验设置3个平行组，结果取均值。

1.2.7 硒含量曲线的测定

设置4组实验，亚硒酸钠浓度分别为0、50、75、100 mg/L，按1.2.3条件培养，每12 h取样测定米曲霉细胞中的硒总量。每组实验设置3个平行组，结果取均值。

1.2.8 蛋白酶活性测定

参照GB/T 23527—2009，采用福林酚法测定蛋白酶活性。

1.3 酱油生产

以富硒实验得到的米曲霉为菌种，采用高盐稀态工艺生产酱油。酱油酿造工艺流程见图1。

图1 高盐稀态酱油酿造工艺流程

2 结果与讨论

2.1 亚硒酸钠浓度对米曲霉生物量的影响

硒是重金属离子，在培养基中添加亚硒酸钠会对米曲霉产生抑制作用，而菌体数量对酱油生产至关重要。米曲霉生长曲线见图2。

图2 米曲霉生长曲线

由图2可知，亚硒酸钠浓度高(100 μg/L)时生物量最大、浓度低(50 μg/L)时生物量最小，可能是由于在一定浓度范围内，硒作为生物体的必需元素会促进菌体的生长。

2.2 硒标准曲线

在酸性条件下，Se 4+与2,3-二氨基萘(DAN)反应生成4,5-苯并苤硒脑，用环己烷萃取后，在波长为376 nm的激发光作用下，发射波长为520 nm的荧光，测定其荧光强度。硒标准曲线见图3。

图3 硒标准曲线

2.3 亚硒酸钠浓度对米曲霉富硒量的影响

最佳的亚硒酸钠浓度不仅可以优化酱油富硒效果、提高产品质量，还可以避免富硒培养时间过长而导致的菌体老化。菌体硒含量变化见图4。

图4 菌体硒含量变化

2.4 亚硒酸钠浓度对米曲霉蛋白酶活性的影响

在酱油生产过程中，米曲霉的主要作用是分泌产生中性蛋白酶，将培养基中的蛋白质水解成氨基酸。蛋白酶活力变化见图5。

图5 蛋白酶活力变化

2.5 酱油感官指标

以不同浓度亚硒酸钠富硒培养酿造的酱油感官指标略有不同。酱油感官指标分析见表1。

表1 酱油感官指标分析

2.6 酱油理化指标

亚硒酸钠浓度为50 μg/L时，氨基酸态氮和全氮含量最高；浓度为75 μg/L时，氨基酸态氮和全氮含量与空白组相近；浓度为100 μg/L时，三项指标均最低。酱油理化指标分析见表2。

表2 酱油理化指标分析

2.7 酱油中硒元素含量

富硒培养米曲霉可以显著提高酱油中硒含量。酱油中硒元素含量变化见表3。

表3 酱油中硒元素含量变化

3 结论

通过添加不同浓度的亚硒酸钠富硒培养米曲霉，再以米曲霉为菌种，运用高盐稀态酿造工艺生产黑豆酱油。根据所酿造酱油的感官指标、理化指标及富硒结果，分析得出黑豆酱油最优富硒工艺，即以75 μg/L的亚硒酸钠富硒培养米曲霉、以高盐稀态酿造工艺生产酱油。