着丝粒蛋白U在肝细胞癌中的表达及其临床意义*

2021-12-21陈静胡进静李汛王海平张璐

西部医学 2021年12期

陈静胡进静李汛,,3,4,5 王海平张璐

(1.兰州大学第一临床医学院，甘肃兰州 730000； 2.甘肃省生物治疗与再生医学重点实验室，甘肃兰州 730000；3.兰州大学第一医院普外科，甘肃兰州 730000；4.兰州大学医学院肿瘤防治中心，甘肃兰州 730000；5.甘肃省肝胆胰外科研究所，甘肃兰州 730000)

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率高[1]。由于肝癌早期发病隐匿，临床表现不明显，确诊时已是晚期[2]。肝癌的发生和发展与肿瘤抑制基因的丢失和癌基因的激活有关[3]。目前尚不清楚其潜在的分子机制。因此，迫切需要探索具有高特异性和敏感性的有效生物标志物用于肝癌的诊断和预后，从而改善肝癌的生存率。着丝粒蛋白U(Centromere protein U，CENPU)是2004年首次发现的一种着丝粒结合蛋白，是着丝粒-动粒复合体(Centromere kinetochore complex，CKC)重要组成部分，若其发生异常或缺乏会导致CKC结构及功能发生变化，染色体不稳定性增加，导致基因组突变，从而引起肿瘤的发生[4-5]。目前越来越多的研究表明，CENPU表达的异常是许多肿瘤共有的特征，其可在多种恶性肿瘤中呈高表达，参与肿瘤的增殖、迁移、侵袭及凋亡等过程，其高表达与恶性肿瘤的不良预后密切相关[6-15]。但关于CENPU在肝癌的发生和发展中的作用未知。本研究首先通过TCGA数据库预测CENPU在HCC患者中表达情况及其与HCC患者预后的关系，进一步通过免疫组化验证CENPU蛋白表达水平与肝癌的关系及对预后的影响，以评价CENPU是否可作为监测HCC患者预后标志物的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2010～2012年在兰州大学第一医院行肝肿瘤切除术并经病理证实为肝细胞肝癌的患者中选择80例患者的临床病理特征相关数据，包括年龄、性别、肝功能、Child-Pugh分级、肿瘤大小、分化程度、包膜、淋巴结受累、血管侵犯、治疗方案等。纳入标准：所有患者术前和术后复发前未行化疗、放疗、介入治疗、消融治疗或靶向治疗，影像学检查结果确定有无转移、肿瘤位置，术后病理学检查证实为原发性HCC。排除标准：继发性肝细胞癌、合并其他慢性疾病者等。并对于纳入患者的基线特征进行表述并与人群特征进行比较，确认纳入患者与人群的临床病理特征无显著性差异。所有患者在研究前均已签署知情同意书。所有患者均经随访至患者死亡。该研究获得兰州大学第一医院伦理委员会的批准，根据机构审查委员会的规程，每位患者均获得了知情同意。研究方案符合1975年《赫尔辛基宣言》的道德准则。

1.2 数据下载研究中使用的529例肝癌患者(其中有371例癌组织和50例正常组织)CENPU基因测序信息及临床信息来源于UALCAN在线数据库(数据来源于TCGA数据库)，比较两种组织中CENPU mRNA表达量的差别。同时，根据RNA seq数据，以CENPU mRNA表达量的中位数为界将肝细胞癌分为高表达与低表达两组，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，总生存时间从疾病诊断开始计算至患者死亡。无病生存率分析CENPU对肝癌患者的预后价值。

1.3 免疫组化石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3 min微波炉对组织抗原进行修复，具体步骤按照文献操作[16]。抗体(Gene Tex，Cat No.GTX48708)。免疫组化结果均由2位病理医师独立进行评估，以保证结果的真实性。CENPU为细胞浆及胞核着色，评分采用阳性细胞比例方法：0分<5%；1分6%～35%；2分36%～70%；3分> 70%。为了进一步明确CENPU蛋白表达水平与HCC患者的临床病理特征之间的相关性，根据CENPU蛋白的表达量进行分组，高表达(2分或者3分)，低表达(0分或则1分)，见图1。

图1 肝癌组织中CENPU的代表性免疫染色图片

2 结果

2.1 CENPU mRNA在肝癌组织中表达情况 CENPU mRNA在HCC患者肝癌组织中的表达水平明显高于正常肝组织，差异具有统计学意义(P<0.0001)，见图2A；且在HCC患者，按不同病理分期分为4组，病理分级采用Edmondson-Stein方法，CENPU的mRNA在肝癌组织中的表达量随着病例分级逐次递增，见图2B。

图2 在UALCAN数据库分析CENPU mRNA表达情况

2.2 HCC组织中CENPU蛋白与临床病理特征的关系 CENPU的蛋白表达量与肿瘤患者年龄、性别、病理分级、肿瘤大小、肿瘤数目、肝硬化结节的数目、肿瘤包膜是否完整、肿瘤的分期及分级、是否具有HBsAb、是否感染HBV及HCV、生化指标均无关系(P>0.05)，见表1。

表1 CENPU不同表达量与临床病理指标相关性分析

2.3 CENPU蛋白在HCC患者中表达与患者生存期的关系首先通过GEPIA在线数据库预测分析显示，生存曲线结果显示低表达组总生存期(OS)以及无瘤生存期(DFS)显著高于高表达组(P<0.05)，见图3。根据TCGA的数据结果初步可知CENPU在HCC患者的高低表达可作为HCC患者的与肝癌患者的预后具有一定的相关性。前述免疫组化染色强度评分方法，有7.6%(6/79)的HCC组织显示阴性(0分)，38%(30/79)的HCC组织显示弱阳性(1分)，40.5%(32/79)的HCC组织中显示中度染色(2分)，13.9%(11/79)的HCC组织呈现强阳性(3分)。在79例病理组织中低表达人数有36例(45.6%)，高表达有43例(54.4%)，比较差异无统计学意义(P=0.072)。CENPU蛋白在肝癌中高表达组患者的总生存期低于低表达组患者的生存期(P=0.023)，见图4。但CENPU蛋白的高低表达与HCC患者的无瘤进展期无相关性(P=0.184)。

图3 肝癌患者中CENPU的mRNA上调与预后不良有关

图4 基于CENPU蛋白表达水平的HCC患者生存曲线

2.4 肝癌总生存率预后指标的单因素和多因素Cox比例风险回归分析进一步采用Cox比例风险回归进行单因素分析发现，CENPU表达水平、病理分期、GGT是HCC患者总生存期的危险因素。多因素分析显示，CENPU表达水平、病理分期、GGT显示是影响HCC患者总生存期的因素，见表2。

表2 肝癌总生存率预后指标的单因素和多因素Cox比例风险回归分析

3 讨论

肝癌为发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤，近年来从发病危险因素分析到早期诊断、疗效监测和预后评估的分子标志物的寻找，再到放化疗耐药机制的探讨，以及靶向药物的研发成为了研究的热点，并且取得了一定的进展[17-19]。HCC的发生、发展主要由复杂的遗传因素(遗传风险因素、基因变异等)和环境因素协同作用，共同促进肝炎-肝硬化-肝癌的转变效应[20]。因此找到预测患者预后的指标，亦或者寻找潜在的治疗靶点，是有效提高肝癌患者生存期的途径。

课题组前期通过加权基因共表达网络(Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)方法研究肝细胞癌(HCC)中肝癌干细胞相关基因表达及其与预后的相关性[21]。我们通过进一步的筛选发现CENPU与肝癌患者的预后密切相关。CENPU是一种着丝粒结合蛋白，在整个细胞周期中都被定位在着丝粒中,被确认为着丝粒的组成成分，在细胞周期进程中发挥重要作用。CENPU基因在多种恶性肿瘤中呈高表达，其在多种癌症中过表达与肿瘤的不良预后密切相关，但在肝癌中尚无关于其与患者预后影响的相关研究，遂本实验展开了相关研究，以期了解CENPU是否是影响HCC患者预后的因素，是否可以作为监测HCC患者不良预后的指标。

本研究首先通过UALCAN在线数据库预测其mRNA水平高表达与HCC患者不良预后相关，提示其可能作为一种促癌基因参与到肝癌的进展中，导致疾病的进展，从而降低患者生存期。这与膀胱癌、腔内乳腺癌组织中的结果相一致[11,22]，CENPU较邻近的正常组织表达显著上调，并且CENPU高表达与患者预后不良相关[12,23]。Wan等[24]通过基于生物信息学的分析鉴定CENPU是与肝细胞癌相关的新基因，其可能为监测肝细胞癌的一种潜在标志物，而在此前是否参与致癌作用，需要进一步的分子生物学来探讨其参与肝癌的分子机制。Wang等[25]在探索具有可能用作血清/血浆生物标志物的新型circRNA及其在肝细胞癌(HCC)发病机理中发现CENPU是肝癌不良预后的指标。

本实验进一步采用免疫组织化学染色法验证CENPU在蛋白水平上表达情况。通过比较CENPU表达量与肝癌患者的临床资料，发现其与患者的年龄、性别、病理分级、肿瘤大小及数目、AFP的表达量、肿瘤包膜是否完整、是否感染HBV及HCV以及生化指标等临床基本特征均不相关。由于本研究标本数量较少，具有一定的偏倚性，所以需要进一步多中心、大样本量进行验证。而通过Kaplan-Meier分析发现，HCC组织中高表达CENPU患者总体生存率均显著低于低表达者，表明HCC患者组织中CENPU表达水平和临床预后紧密相关，有望应用到临床上通过监测该指标，为患者预后评估予以一定的指导。Yang等[10]发现CENPU基因对细胞增殖、凋亡和细胞周期进程的影响，CENPU的表达水平与淋巴结转移和肿瘤大小有关。本研究中通过Cox比例风险回归单因素和多因素分析结果表明，CENPU表达水平、患者的病理分期、GGT指标可作为影响HCC患者总生存期的危险因素。本研究存在不足之处：其一，本次收集的样本量较少，需要加大样本量进行验证；其二，未进行与正常患者肝组织标本进行比较，无法证实肝癌患者正常肝组织CENPU的表达量；其三，未进行相关分子生物水平上的机制研究，所以需要进一步研究CENPU在肝癌中具体机制以更好地指导其临床应用。