徐晶晶，刘 鹏，郑书旗，陈 波，杨新兵

（1.河北农业大学 林学院，河北 保定 071001；2.北京市林业果树科学研究院，北京 100093；3.北京沃尔德防灾绿化技术有限公司，北京 100048）

一直以来，人类活动都影响着大气中的臭氧（O3）浓度，从过去的100 多年到现在，人类活动导致排放到大气中的O3不断增加[1]；对流层O3是如今主要的空气污染物之一，其前体物一般为氮氧化物（NOx）和挥发性有机化合物（VOCs）等[2]。由于城市化进程的加快，人类活动使得排放到大气中的O3前体物大量增加，为近地面O3浓度的升高创造了条件。O3引起的污染在城市地区尤其是我国的京津冀、长三角和珠三角城市群比较严重[3-4]。2019年全国338 个地级及以上城市PM2.5、PM10、SO2、NO2、CO 等都有不同程度下降，唯有O3浓度为 148 μg/m3，同比上升了6.5%[5]，这种情况已经引起学术界的关注。近年来，O3浓度在北京市也呈逐年增加趋势[6]，北京市环保局监测结果显示从2013—2015年，北京市每日（8 h）最大O3平均浓度从183.4 μg/m3增加到了202.6 μg/m3[7-8]，O3已经成为该地区夏季的首要污染物；2017年5月环保部向媒体通报，称根据最新空气质量预测预报结果，京津冀及周边地区首要污染物为O3；2019年北京市O3日最大8 小时滑动平均第90 百分位浓度值为191 μg/m3，超过国家二级标准（160 μg/m3）19.4%[9]。

近年来一些学者应用其他方法如人工控制气室模拟实验（封闭式O3熏蒸实验法、大型人工气候室法、开顶式气室法（OTC），还有自由空气熏蒸气室法（FACE））等研究O3对农作物和树木的危害[10]。一些研究者从植物个体的各项指标中发现，植物长期暴露在O3环境中，其生理会出现一系列的变化，如树叶早衰和脱落，气孔数量减少[11]，光合固碳能力降低，回流根内的碳素同化物减少等[12-13]。Schaub 等[14]研究证明O3的吸收影响野黑樱桃Prunus serotina的光合作用和电导，尤其是在生长季节的后期。

在北京，随着O3污染的日益严重，O3对植物的影响也越来越大。万五星等[15]通过野外实地观测，发现北京郊区出现了大量的树木、灌木和草本植物叶片受O3危害的现象。在未来O3浓度还将继续增加的前提下，植物受其危害的程度也将继续加大[16]。有关不同O3浓度对白皮松的各项指标间的影响关系研究较少，而且对于这种影响的程度探讨也较少。在O3浓度升高的情况下，白皮松的哪些指标反应最迅速、哪些指标受到的影响最大、这些指标又是怎样影响白皮松的生长和发育的，这些问题尚无明确定论，需要深入分析。为此，本研究利用开顶式气室研究O3浓度升高的情况下，白皮松的生长、生理、光合以及O3吸收指标的变化，从而为从生理角度研究树木对O3胁迫的响应提供数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 研究地概况与试验材料

研究地北京植物园（39°48′N，116°28′E）位于香山脚下，海拔76 m，属温带大陆性气候。年均温11.6℃，1月份均温-3.7℃，7月份均温26.7℃。极端高温41.3℃，极端低温-17.5℃，年降水量634.20 mm，相对湿度43%～79%。白皮松Pinus bungeana是华北地区常见的园林绿化树种，在研究地被广泛种植。它适应性好，抗逆性强，是山区和半干旱地区造林的优良树种，也是城市绿化的首选树种之一。本研究选择白皮松幼苗为材料进行人工控制的盆栽试验。白皮松幼苗均为3年生，有研究表明3年生的树木处于生长发育的早期，使得研究结果更显著[17]。苗木花盆直径为40 cm，高为50 cm。不同气室内的白皮松幼苗大小、冠幅、基径和株高基本一致。

1.2 试验方法

每个开顶气室（OTC）内放置3年生白皮松幼苗9 株。共设置15 个OTC，利用O3发生器控制进入气室内的O3浓度，O3发生器出口设置O3浓度检测仪BMT 964。其中一个OTC 内不做任何O3相关处理，为NF 浓度（正常大气环境O3浓度）；另外两个分别以NF40（正常大气环境O3浓度加40 nmlol/mol）和NF80（正常大气环境O3浓度加80 nmol/mol）的浓度进行熏蒸处理，每3 个OTC为一组，共5 组。

表1 试验处理方式Table 1 Different processing methods in experiment

1.3 功能性状指标的测定

在试验开始和结束时，用尺测量白皮松株高和50cm 处直径，分别计算差值，得到株高变化（ΔH）和50 cm 处直径变化（ΔDBH）。采用光学显微镜观察视野中气孔的数目，计算视野面积，视野密度（M）=视野中气孔的平均数/视野面积，单位为“个/mm2”。用比例法可求得气孔的实际大小（S/μm2）和气孔开度（K/μm2）。应用CI340 光合仪测定不同处理下的白皮松净光合速率（Pn/μmol·m-2s-1）、蒸腾速率（Et/mnol·m-2s-1）、胞间CO2浓度（Ci/μmol·mmol-1）、气孔导度（Gs/mnol·m-2s-1），并通过公式计算水分利用率（WUE/μmol·mmol-1），WUE=Pn/Et。叶绿素含量（CHL/mg·g-1）则采用分光光度计测定。最大光化学效率（Fv/Fm）利用Yaxin-1161G 叶绿素荧光仪测定；相对电导率（L）通过电导仪（DDS-307）测定初始和最终电导值计算比例得到。整树耗水量（W）和O3吸收速率（FO3）通过树干液流技术测定并计算[18]。

1.4 数据处理

使用SPSS 24.0 软件和Canoco 5.0 软件对测试数据进行整理，并进行聚类分析、相关性分析、冗余分析和单因素方差分析，研究各指标间的相关性，以及在不同O3浓度的处理下，各项指标是否有显著差异，以系统评价不同浓度梯度O3对白皮松的伤害。

2 结果与分析

2.1 O3 胁迫下白皮松各特性指标的聚类分析

用SPSS 软件，将测定的所有指标标准化，进行系统聚类分析（图1）。可以将15 项指标分为15 类、13 类、8 类、7 类、5 类、4 类、3 类、2 类和1 类。为了便于统筹分析，结合植物生理学知识，我们将测试的所有指标分为5 个大类和7 个小类别。第一类包括ΔH、FO3、W、ΔDBH、Pn、Gs、Et和CHL，其中又分为ΔH、FO3、W、ΔDBH 和Pn、Gs、Et、CHL 两小类；第二类为M、K、S和Fv/Fm；第三类为WUE；第四类为Ci；第五类为L。

图1 指标聚类分析Fig.1 Cluster analysis

第一类指标主要反映的是白皮松的生长状况、O3吸收状况以及光和能力，其中株高和50 cm 处直径反应的是白皮松的生长情况，耗水量和O3吸收速率反应的是白皮松吸收O3的情况。典型相关分析表明两组数据之间呈高度正相关（P＜0.001），相关性为0.998。表明株高变化（ΔH）、O3吸收速率（FO3）、耗水量（W）与50cm处直径变化（ΔDBH）随O3浓度升高出现十分类似的变化。Pn、Gs、Et和CHL 反应了白皮松的光合生理特性，从组内平均数连接距离来看，白皮松的光合生理指标与生长状况和O3吸收状况接近，表明白皮松的部分光合生理特性的改变可能与其生长变化和O3吸收状况有密切的关联。

第二类指标M、K、S和Fv/Fm，主要反映的是气孔特性与最大光化学效率，它们随着O3浓度升高而降低。气孔指标与Fv/Fm之间呈现正相关，相关系数为0.946（P＜0.001）。

第三类指标为水分利用效率（WUE），随着O3浓度的升高表现为逐渐降低。

第四类指标为胞间CO2浓度（Ci），随着O3浓度的升高，白皮松Ci逐渐升高。第五类指标为相对电导率（L），与它变化最接近的指标为胞间CO2浓度（Ci）。

2.2 O3 胁迫下白皮松各特性指标间的相关关系

Ci和L呈正相关，相关系数为0.775，二者与其余生理因子均呈负相关（表2），说明随着O3浓度的升高二者的变化趋势一致，而胞间CO2浓度（Ci）和相对电导率（L）的升高，表明了白皮松的叶片细胞结构可能遭到了一定程度的破坏。ΔH、ΔDBH 均与W、FO3相关性最高，相关系数均在0.92 以上，说明白皮松对O3的吸收以及对水分的耗用显著影响了自身的生长。M、K两项指标与S相关性最高，相关系数在0.92 以上，说明气孔的密度和开度变化与气孔大小有较强的关联。WUE 与Gs相关性较高，相关系数为0.79。Pn、Et与Gs三者间的相关性很高，相关系数均大于0.91，这3 项指标与白皮松的光合特性密切相关，且随着O3浓度升高三者的变化相一致。冗余分析结果表明（图2），Ci、L与O3浓度呈现高度的正相关，其余指标与前三者呈现负相关，并且WUE、CHL、Pn、Et等光合生理特性与O3浓度相关性最高，随着O3浓度的升高，白皮松的光合性能越来越低。

表2 白皮松各特性指标的相关性分析Table 2 Correlation analysis of indices of Pinus bungeana

图2 白皮松生长、生理和吸收特性与O3 的RDA 排序Fig.2 RDA sequence of growth,physiology,uptake characteristics and O3

2.3 不同浓度O3 对白皮松影响的差异性

通过方差齐性检验，结果显示株高变化（ΔH）、蒸腾速率（Et）和胞间二氧化碳浓度（Ci）不满足方差齐性（P＜0.05），其余指标均通过方差齐性检验。将这些指标进行方差分析，来得到不同处理下的白皮松指标值差异。

在对照试验中，白皮松的各项指标的差异均变化显著（P＜0.001），表明O3浓度高低对试验测试的所有指标都有较大的影响（表3）。F值大小排序为：FO3＞W＞S＞M＞Gs＞K＞ΔDBH＞Fv/Fm＞L＞CHL＞Pn＞WUE，表明NF、NF40和NF80 处理下，O3吸收特性和气孔变化最大，反应最为敏感，其次是白皮松的生长状况，最后是生理和光合特性。

由于株高变化（ΔH）、蒸腾速率（Et）和胞间二氧化碳浓度（Ci）不满足方差齐性（P＜0.05），采用非齐性多重比较（表4）。不同O3浓度处理下的白皮松高度变化（ΔH）均表现出明显差异（P＜0.05），其中NF 气体室内白皮松幼苗高度变化（ΔH）和NF40、NF80 气室相比差异极显著（P＜0.001），NF40 与NF80 处理下的ΔH差异相对较小。而蒸腾速率（Et）与胞间CO2（Ci）浓度则相反，NF40 与NF80 处理下的差异最为显著（P＜0.001），其次是NF 与NF80 处理，NF 与NF40 处理下的差异不显著（P＞0.05）。

其余指标不同处理下的差异则采用齐性方差分析多重比较（表5），NF 与NF40、NF 与NF80处理下的ΔDBH 差异极显著（P＜0.001），NF40与NF80 处理下的ΔDBH 差异较小，表明在NF40处理下白皮松生长已经受到较为明显的抑制；K、S在NF、NF40 和NF80 三项处理均差异显著（P＜0.001），表明气孔特性在不同臭氧浓度下变化最为活跃，其中NF 与NF80 的O3浓度处理下K、S差异最为显著，其次是NF40 与NF80；M在NF、NF40 处理下差异较显著（P＜0.05）；WUE 在NF 与NF80 处理下差异最大，其次是NF40 与NF80，NF 与NF40 差异性不显著（P＞0.05），这表明白皮松的水分利用率在更高浓度的O3胁迫下才会有明显的降低；Pn和Gs在NF 与NF80 处理下差异最大（P＜0.001），在NF 与NF40 处理下差异较显著（P＜0.05），NF40 与NF80 处理下差异相对较小；Fv/Fm在NF 与NF40 处理下差异最不显著，NF40 与NF80 相比Fv/Fm差异显著，NF 与NF80 差异最为显著（P＜0.001）；CHL在NF、NF80 处理下差异最显著，其次是NF 与NF40，NF40 与NF80 差异最小；L在NF 与NF40处理下差异最不显著，而其它两组对比差异显著（P＜0.001）；W和FO3在NF40 与NF80 处理下差异较小，其中W在两组处理中差异较显著（P＜0.05），FO3差异不显著（P＞0.05），在NF 与其它两组处理下W和FO3差异较大。

表5 多重比较分析Table 5 Multiple comparisons

3 讨 论

在整个试验期间，可以测量到白皮松的生长指标随着不同浓度的O3熏蒸处理表现出差异，NF80 处理下的白皮松株高和直径均低于NF40，NF40 处理下的低于NF，表明O3抑制白皮松幼苗生长。这与牛骏峰[19]等对杂交杨Populus tremula×P.tremuloides的研究结果一致，O3影响下的杂交杨株高、直径以及生物量均低于正常环境的值。通过聚类分析、相关性分析以及冗余分析可以发现，白皮松生长指标（ΔH、ΔDBH）与O3吸收状况（FO3、W）相关性最高，这是因为O3进入植物体内影响了各部分的功能，从而导致植物对水分的吸收减少，对植物器官的供应也产生一定的影响，会进一步导致植物生长缓慢。

气孔是气体进入植物体内的主要通道。一般来说，气孔开度和大小越大，进入植物体内的O3就越多；当超出了植物体的耐受限度，植物会缩小气孔。试验结果也证实了这一点，在NF、NF40以及NF80 浓度O3的处理下，白皮松的气孔密度、开度和大小均降低。有学者指出，在城市环境中随着污染程度的增加，气孔密度会呈增大的趋势，而气孔面积及气孔开度则有所减小[20]，这可能是因为本研究涉及到的O3与环境中PM2.5、PM10性质有较大差别，在城市污染大气中，部分气孔受到悬浮颗粒物的阻塞影响植物的水汽交换过程，而采取增加气孔数量的策略去弥补也是很有可能的。也有学者表明O3浓度升高会降低气孔灵活性，使得气孔对外界环境的反应变慢[21-23]。气孔关闭的反应速度和O3进入的量值与不同树种对O3的敏感性有关，较敏感的树种在同等O3浓度下耐受值较小，此时可能引起植物的细胞保卫作用失效，不但会使气孔开度和大小增加，同时也使植物无法快速关闭气孔，试验中白皮松未出现此类情况，这可能是因为白皮松的气孔大小和开度均低于宽大叶片的树种，在相同浓度的O3中吸入更少，耐受值更高。气孔特性（K、M、S）与光合生理指标（Pn、WUE、Et、Gs、Ci、CHL、Fv/Fm、L）相关性最高，这是因为植物叶片是光合作用的主要场所，而气孔是O3进入叶片的主要通道，随着O3浓度的升高，植物的气孔大小、密度和开度逐渐下降，会导致进入叶片的CO2大量减少，从而使植物的光合速率、蒸腾速率、气孔导度和水分利用效率等降低。

光合作用是植物最基本的生理过程，长期O3环境对植物的影响也表现在了光合特性中。气孔导度（Gs）下调会导致气孔阻力的增加，CO2和H2O 难以进入到植物内部，进一步影响到植物蒸腾速率（Et）、耗水量（WUE）的变化。叶绿素含量（CHL）是反映树木光合能力的重要指标，对植物光合速率、初级生产力等具有一定的影响[24]，研究发现白皮松CHL 随着O3浓度的升高而降低，这是因为O3可破坏叶绿体的结构和组分[25-27]。试验结果表明O3浓度升高导致白皮松Gs、Et和WUE 均有明显降低。光合速率反映了植物在一定环境下的光和能力，研究表明白皮松的净光合速率（Pn）在NF40 和NF80 浓度的O3处理下，分别下降了11.71%和18.81%。而试验中白皮松胞间CO2浓度（Ci）随着O3浓度的升高而升高，这表明引起白皮松光合能力下降的因素主要是非气孔因素。白皮松的光合生理指标（Pn、WUE、Et、Gs、Ci、CHL、Fv/Fm、L）与生长指标（ΔH、ΔDBH）、气孔特性（K、M、S）和相关性都较高。而本试验中胞间CO2浓度随着O3浓度升高而显著升高，表明造成白皮松光合速率等光合指标降低的因素不只是气孔因素，可能是由叶肉细胞同化能力降低等非气孔因素所致[28]。此外，有研究表明O3升高使光合电子传递链受阻[29]，降低叶绿素荧光参数Fv/Fm（最大光化学量子产量），这与本试验中对白皮松的研究结果一致，叶绿素在O3这种强氧化剂下分解，导致植物光合作用受到影响，也进一步促使最大光化学速率（Fv/Fm）等降低。相对电导率（L）的大小能反映植物细胞膜受害程度，通过测定植物的相对电导率变化值可以了解植物膜系统受伤程度[30]。本研究显示随着O3浓度升高，白皮松L值逐渐增大，这是因为O3是一种强氧化剂，可以改变膜透性，O3通过气孔进入叶片，细胞膜受到破坏，相对电导率（L）就随之增加，说明白皮松叶片细胞膜已经受到了明显的损害。相比NF 浓度，NF40 和NF80 下水分利用率（WUE）分别减少了2.62%和6.70%,说明O3浓度升高抑制了白皮松耗水。光合能力下降则难以维持植物正常生长所需的养分，进一步导致植物生长变缓。

通过对比不同气室的白皮松生长情况发现，NF 和NF80 的O3处理下，白皮松的各项指标差异均显著（P＜0.05），说明白皮松对O3浓度大幅度升高会产生比较明显的响应。一些指标（ΔH、ΔDBH、M、CHL、Pn、Gs、W和FO3）在O3浓度上升到NF40 时就会出现较明显的反应，在更高浓度的处理中表现出的差异不明显，说明NF40 浓度梯度下更多影响到的是白皮松生长和O3吸收情况，以及气孔密度和部分的光合能力。而一些指标（K、S、WUE、Fv/Fm、Et、Ci、L）则 在NF40 与NF80处理下表现出更明显的差异，在NF 与NF40 处理下差异显著性相对较小，一方面表明白皮松具有一定的抗O3能力，因为NF40 浓度就已经接近O3引起植物伤害的阈值，甚至NF80 已经超过引起植物伤害的阈值[31]；另一方面表明O3浓度升高到NF80，对白皮松的生理特性、气孔特性和部分光和能力会产生较大的影响。

本研究仅选择了两个O3浓度梯度与正常环境大气O3浓度进行对照试验，且临界值是浮动值，受到正常环境下大气O3浓度的影响；仅针对O3胁迫下的生长、光合、部分生理指标和吸收特性之间的关联进行了研究，对于其抗性指标未进行试验与测定。对开顶气室内的正常环境O3进行预处理，以达到相对一致稳定的浓度；细化O3浓度梯度以研究和比较各个指标产生变化的阈值，并加入O3胁迫下白皮松抗性（抗氧化系统）的定量分析，将是下一步研究的方向。

4 结 论

本研究以白皮松为研究对象，分析了其功能性状对不同浓度O3胁迫的响，得出如下结论：

1）白皮松的株高增长（ΔH）、50cm 处直径增长（ΔDBH）、气孔大小（S）、气孔密度（M）、气孔开度（K）、气孔导度（Gs）、净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Et）、水分利用率（WUE）、最大光化学效率（Fv/Fm）、叶绿素含量（CHL）、整树耗水量（W）和O3吸收速率（FO3）均随着O3浓度的升高而降低；而胞间CO2浓度（Ci）和相对电导率则随着O3浓度的升高而升高。

2）O3胁迫下白皮松生长指标（ΔH、ΔDBH）与O3吸收状况（FO3、W）相关性最高，其次是光合指标（Pn、WUE、Et、Gs、Ci）与生长指标（ΔH、ΔDBH）和气孔特性（K、M、S），部分生理指标（L、Fv/Fm）与光合（Pn、WUE、Et、Gs、Ci）和气孔（K、M、S）的相关性相对较弱。

3）O3与白皮松植物功能性状间关系密切，相比NF 浓度，NF40 浓度下白皮松白皮松生长（ΔH、ΔDBH）和O3吸收（W和FO3），以及气孔密度（M）和部分的光合能力（Pn、Gs）指标明显下降；相比NF40 浓度，NF80 浓度下白皮松生理特性（Fv/Fm、L）、气孔特性（K、S）和部分光和特性（WUE、Et、Ci）产生更明显的差异。

4）在试验期间，即使是在NF80 浓度下白皮松也并未停止生长，也并没有出现气孔反应延迟或失调等情况，说明其在O3胁迫的条件下，仍能通过调整叶功能性状维持着自身生长与体内物质循环的平衡，也初步证明它有一定的抗O3能力。