黄 玮

（江苏省徐州市食品药品监督检验中心，江苏 徐州 221000）

保儿宁颗粒由黄芪（炙）、白术、防风、芦根、鸡内金、茯苓和山药（炒）7 味中药加工制成，具有益气固表、健中醒脾功效，用于脾肺气虚所致的神倦纳呆、面黄肌瘦、烦躁不宁、表虚自汗、易感风邪等症。原质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第十五册）》，仅有理化鉴别项，无含量测定项［1］。为了更好地控制制剂质量，本研究中增加了白术的薄层色谱（TLC）鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定黄芪中有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、防风中有效成分升麻素苷和5－ O－甲基维斯阿米醇苷含量，旨在为完善保儿宁质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国 Waters 公司），配有 Waters 2998PDA 型检测器；XSR205 型电子天平（瑞士 Mettler 公司，精度为十万分之一）；TL－360 型超声波检测仪（上海声彦超声波仪器有限公司，功率为400 W，频率为 40 kHz）。

1.2 试药

白术对照药材（批号为120925－201611），毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号为111920－201606，纯度为97.6%），升麻素苷对照品（批号为 111522 －201913，纯度为94.6%），5－ O－甲基维斯阿米醇苷对照品（批号为 111523－201208，纯度为 96.5%），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司；保儿宁颗粒（江苏颐海药业有限责任公司，批号分别为 190101，190201，190301）。

2 方法与结果

2.1 白术薄层鉴别［2］535

取样品5 g，研细，加水饱和的正丁醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液用水洗涤3 次，每次20 mL，弃去水洗液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材0.5 g，加水煎煮2 h，滤过，滤液用水饱和的正丁醇振摇提取3 次，每次15 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为对照药材溶液。另取按处方工艺制备缺白术的阴性样品5 g，同法制备阴性对照品溶液。照2015 年版《中国药典（一部）》通则0502 薄层色谱法试验，吸取上述3 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－丙酮 － 甲酸（9.5 ∶0.5 ∶0.06，V ／ V ／ V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点，且阴性对照无干扰。详见图1。

图1 白术薄层色谱图（365 nm）1.Reference medicinal material solution 2 － 4.Test solution 5.Negative reference solutionFig.1 TLC chromatogram of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma（365 nm）

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）－0.2% 磷酸水溶液（B），梯度洗脱 （0 min→20 min→22 min 时 15%A→30%A→15%A）；流速：1.0 mL ／ min；柱温：32 ℃ ；检测波长：215 nm；进样量：10 μL。在此色谱条件下，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素苷和5－ O－甲基维斯阿米醇苷与各自相邻峰的分离度均大于2.0，理论板数均大于6 000。色谱图见图2。

图2 系统适用性试验高效液相色谱图1.prim － O － glucosylcimifugin 2.calycosin 7 － O － glucoside 3.5 － O － methylvisammiosideA.Mixed reference solution B. Test solution C.Negative reference solution without Astragali Radix D.Negative reference solution without Saposhnikoviae RadixFig.2 HPLC chromatograms of the system suitability test

2.2.2 溶液制备

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、升麻素苷和5 － O －甲基维斯阿米醇苷对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解，制成含毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.151 3 mg ／ mL、升麻素苷 0.342 2 mg ／ mL、5 － O － 甲基维斯阿米醇苷0.304 1 mg／mL 的混合对照品贮备液。精密量取上述贮备液各3 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。取样品6 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理 30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别按处方比例及制备工艺制备缺黄芪和防风药材的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：分别配制系列质量浓度的升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和5－ O－甲基维斯阿米醇苷对照品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（A）对进样量（C，μg）进行线性回归，得回归方程 A升＝3.5193 ×107C升＋2.6604 ×104（r ＝0.9999，n ＝6），A毛＝3.904 9 ×107C毛＋1.232 2 ×104（r ＝0.999 8，n ＝6），A维＝2.970 2×107C维＋3.213 8×104（r ＝0.999 9，n ＝6）。结果表明，升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷进样量分别在 0.342 2 ～2.053 2 μg，0.151 3 ～ 0.907 8 μg，0.304 1 ～ 1.824 6 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取同一混合对照品溶液（升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷质量浓度分别为 0.076 93，0.039 58，0.079 71 mg ／mL），按2.2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷峰面积的 RSD 分别为 0.69% ，0.42% ，0.39%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为190301）样品，依法制备供试品溶液，分别于 0，2，4，6，10，24 h 时按 2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷峰面积的 RSD 分别为 1.01% ，1.17% ，0.88% （n ＝ 6），表明供试品溶液在室温下24 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为190301）样品6 份，依法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果升麻素苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷的平均含量为分别0.116 30，0.04882，0.102 60 mg ／g，RSD 分别为 0.97% ，1.19% ，0.77%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为190301，升麻素苷的平均含量为 0.116 30 mg ／g，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰的平均含量为0.048 82 mg／g，5－ O－甲基维斯阿米醇苷峰的平均含量为0.102 60 mg／g）3 g，共6 份，精密称定，置50 mL 容量瓶中，分别精密加入2.2.2 项下混合对照品贮备液1 mL，依法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝ 6）

2.2.4 样品含量测定

精密吸取对照品溶液和3 批（批号分别为190101，190201，190301）样品溶液各 10 μL，按 2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法（峰面积）计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg ／g，n ＝3）Tab.2 Content determination of prim － O －glucosylcimifugin，calycosin 7 － O －glucoside and 5 － O －methylvisammioside in the samples（mg ／g，n ＝ 3）

3 讨论

3.1 TLC 法中供试品溶液制备方法选择

加甲醇超声处理后，取滤液点样，TLC 图斑点较多，分离不好；水饱和的正丁醇超声处理后，滤液水洗后蒸干正丁醇液，用甲醇溶解，点样，TLC 斑点干扰少，主斑点显色清晰。故选择甲醇和水饱和正丁醇超声处理。

3.2 HPLC 法色谱条件选择

波长选择：文献［3－7］报道，采用HPLC 法测定升麻素苷、5－ O－甲基维斯阿米醇苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，测定波长为254 nm，而供试品溶液在检测波长为254 nm 时各成分峰面积较小。通过紫外分光光度法于210 ～400 nm 波长范围内进行扫描，升麻素苷对照品溶液和5－ O－甲基维斯阿米醇苷对照品溶液分别在 214.6 nm 和 213.4 nm 波长处有最大吸收，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液在215 nm 波长处有较大吸收。故选择测定波长为215 nm。

流动相选择：分别以甲醇 － 水（40 ∶60，V ／ V）［2］149，乙腈（A）－0.05% 磷酸水溶液（B）［8］，乙腈 －水溶液为流动相进行梯度洗脱［9］，比较不同流动相对峰形的影响，经调整最终确定流动相为乙腈－0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱程度为0 min→20 min→22 min 时15%A→30%A→15%A，所得各色谱峰的分离度、理论板数及对称性均较好。故确定流动相为乙腈（A）－0.2%磷酸水溶液（B）进行梯度洗脱。

3.3 含量测定项下供试品溶液制备方法选择

考察供试品提取方法及提取时间等影响因素，结果回流和超声处理得率相近，超声处理方法较方便，故选择超声处理，分别提取15，30，60 min，结果超声处理30 min即可提取完全。