张艳慧，郑宝强，缪 崑，侯芳梅，王 雁*

(1.国家林业局林木培育重点实验室/中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091； 2. 北京农学院 园林学院，北京102206)

石斛兰(Dendrobium)是兰科石斛属植物的总称，为兰科(Orchidaceae)的第二大属[1]。石斛属植物有着极高的观赏价值，与卡特兰(Cattleya)、蝴蝶兰(Phalaenopsis)、文心兰(Oncidium)同为世界上四大观赏洋兰[2]。随着人们对观赏石斛消费需求的扩大，观赏石斛的育种已成为越来越关注的热点[3]。有研究表明石斛属内有很多种有自交不亲和现象，部分种也有异交不亲和现象[4]，所以研究石斛属植物胚发育是解决杂交败育及进行胚抢救育种的第一步。

兰科植物中授粉后花粉管的长出会刺激大孢子的发育和雌配子体的形成，持续50～90 d。从授粉到果实成熟需要6～8个月。授粉后6周左右，大花杓兰(Cypripediummacranthum)的种胚发育为球形胚[5]。无距虾脊兰(Calanthetsoongiana)授粉后60 d，合子形成完成受精，合子第一次横向分裂为基细胞和顶细胞，顶细胞发生纵裂，之后经过数次胚细胞的分裂形成成熟的胚胎[6]。扇脉杓兰(Cypripediumjaponicum)授粉前，子房的胎座有稍许分化，在胎座形成一些突起。在授粉10 d后，胎座分化出隆起的胚珠原基，胚原基顶端的孢原细胞，分化为具有明显细胞核的大孢子母细胞，之后胚原基基部的细胞突起形成内珠被，然后外珠被开始发育。授粉后35 d，发育成熟的雌配子体准备好受精。受精后经95 d胚胎发育成熟，其胚胎发育过程和无距虾脊兰类似，也为石竹型[7]。

本研究旨在通过对金钗石斛(Den.nobile)大孢子发生、雌配子体发育以及胚发育等进行研究，为石斛属植物生殖生物学研究提供相关资料，为研究石斛属杂交育种败育现象奠定基础。

1 材料与方法

试验材料为中国林科院科研温室内的金钗石斛。于2017年2、3月份对金钗石斛开花植株进行人工授粉、标记。金钗石斛授粉后每隔10 d取1次果荚，每次3个，以授粉前子房为对照，将样品切块放在2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合溶液中，经1%的锇酸室温固定，然后将样品依次经过50%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液脱水。逐步完成丙酮和Spurr树脂的置换和浸透，样品放入新配制的Spurr树脂中静置1 h后放入60 ℃烘箱中24 h完成包埋与聚合，将包埋好的样品用超薄切片机切片，切片厚度3 μm，在切片上滴加数滴浓度为0.5%的甲苯胺蓝溶液，染色3～4 min后，用蒸馏水冲洗干净，在光学显微镜下观察然后拍照。

2 结果与分析

2.1 大孢子发生和雌配子体发育

金钗石斛的子房为侧膜胎座三心皮(图1-A)，在授粉前，胎座未发育(图1-B)。授粉后，胎座之间空隙变大，胎座上细胞开始迅速增殖分裂，在内膜脊上形成指状突起，授粉后10 d每个胎座上分化出一些小枝(图1-A)。授粉后20 d，每个胎座上的小枝又继续分化，指状突起数量变多(图1-C,D)。随着胎座小枝上细胞持续分裂，子房不断膨大。授粉后30 d，指状突起分化为成千上万个胚珠原基，由一列细胞外加一层表皮细胞组成，位于胚珠原基末端的细胞体积增大变为孢原细胞(图1-E)。

授粉后40 d，相对于其他细胞，体积明显增大，孢原细胞变为细胞核明显的大孢子母细胞(图1-F)。随着大孢子母细胞的体积不断增大，胚珠原基开始弯曲，最后整个胚珠体发生180度的转换(图1-G)，珠柄与珠孔靠近，形成倒生型胚珠。孢原细胞发育为大孢子母细胞之后，胚珠原基基部的表皮层细胞向外突起生长形成衣领状结构，为内珠被(图1-G)。随后，外珠被也开始发生，由内珠被靠近底部的细胞分化而来(图1-H)。在受精前，内珠被不断向上生长，包住大孢子母细胞，在雌配子体成熟前后内珠被生长完成，包住珠心，形成珠孔。随着内珠被的不断生长，大孢子母细胞也不断伸长(图1-I)。

授粉后60 d左右，大孢子母细胞体积不再继续扩增，准备进行减数分裂。大孢子母细胞减数第一次分裂是横向的，产生2个不对称的细胞(图1-J)，靠近珠孔方向的细胞较小很快便压缩退化(图1-K)，合点方向的功能性二分体细胞较大，接下来发生横轴方向上的减数第二次分裂，形成具有4孢子的直列式四分体， 4个孢子中只有1个参加雌配子体的发育(图1-L)，其余3个在四分体形成的过程中先后退化。参加雌配子形成的大孢子进行有丝分裂，第一次分裂形成初生珠孔核和初生合点核(图1-M)；第二次分裂珠孔方向产生一对核，合点方向产生一对核(图1-N)；第三次分裂珠孔方向和合点方向各形成4个核，这种由单孢子分裂形成的八核胚囊称为蓼型胚囊(图1-O)。从授粉到雌配子体成熟大约需要70 d的时间，但即使是同一子房其雌配子体发育的时间也不完全一致。

2.2 受精后胚的发育

配子结合形成受精卵后，细胞质呈均匀状态(图2-A)。授粉后80 d合子进行第一次分裂，分裂为两个细胞，包括1个基细胞和1个顶细胞(图2-B)，顶细胞在合点方向，细胞体积小，基细胞靠近珠孔方向，液泡很大，基细胞之后会分化为胚柄，胚柄起固定胚体的作用，其他组织细胞的养分可以通过胚柄运输至胚。授粉后90 d，金钗石斛的顶细胞发生横轴方向上的分裂，基部的细胞不分裂，形成一列三细胞原始胚(图2-C-D)，依此判断金钗石斛的胚发生类型为石竹型。但偶有切片观察发现顶细胞首次分裂为纵轴方向上的分裂(图2-E)。一列三细胞原胚接下来的分裂也分为两种情况：原胚顶端细胞发生纵轴方向上的分裂形成4细胞T型胚体(图2-F-G)；两个顶细胞同时在纵轴方向上分裂(图2-H)。继续分裂形成6细胞、8细胞原胚，同时胚柄体积增大。在胚发育的整个过程，内珠被没有发育，和外珠被细胞相比，内侧的珠被细胞较小，由一层紧密排列的细胞组成，受精之后并逐渐退化浓缩成为一层紧密包裹胚体的超薄细胞。

授粉后110 d，多次分裂后顶细胞形成早期球形胚(图2-I-K)。授粉后120 d，胚细胞继续分裂，数量变多，囊腔被填充满，此时胚柄细胞已开始裂解(图2-L-M)。授粉后150 d，早期原胚发育为球形胚，胚柄只留下痕迹，基本完全消失(图2-N-O)。之后，胚体积稳定，有丝分裂停止，胚细胞细胞质非常浓厚(图2-P)。

直至授粉后180 d，金钗石斛种子成熟，胚体大有8～12细胞长，6个细胞的宽度。成熟的种子分为三部分：内种皮、外种皮、胚。随着胚的发育，由于珠被细胞脱水皱缩，内外珠被之间形成空气腔，一直到种子成熟，空气腔仍没有消失(图2-P)。

3 结论与讨论

一般有花植物的胚珠是伴随着花的发育过程逐渐成熟的，但兰科植物胚珠发育具有独特的模式，即在授粉前胚珠没有发育或仅有部分不完全发育，只有在授粉后才能启动进一步的发育。金钗石斛雌配子发育的特点与树兰(Epidendrumibaguense)[5]、卡特兰(Cattleya)[7]、无距虾脊兰(Calanthetsoongiana)[7]和舌唇兰(Platantherasusannaeil)[8]相同，在授粉前胚珠并没有开始发育，只有在授粉后才开始发育；杓兰类(Cypripedium)[9.10]、玉凤兰(Habenriagrandifloriformis)[8]、火烧兰属(Epipactis)[11]授粉前胚珠已经开始发育，只是不能分裂形成大孢子细胞，授粉后大孢子才能进一步发育。在植物进化史上，兰科植物被认为是进化程度最高的，这可能是在长期的自然选择中进化出最节省能量的方式—只有授粉后胚珠才能真正开始发育。

对不同植物而言，从花粉落到母本柱头到受精的时间差别很大，短则几分钟，长则几天数月，兰科植物相对于其他植物从授粉到受精间隔时间较长，本研究发现，金钗石斛授粉后70 d完成受精。金钗石斛授粉前胎座未发育，授粉后胎座上有隆起发生，子房有少许膨大。说明授粉后产生了某种刺激而促使胎座发育，这种刺激有可能是人工授粉导致的，也有可能是花粉管生长过程中对子房的刺激从而产生了某些激素或某些物质，这些激素能够调节其他营养器官的养分运输到子房，从而促进胚珠的发育。蝴蝶兰授粉后刺激体内产生了乙烯从而促进了胎座的发育[12]，金钗石斛的胎座发育是由上述哪种情况引起，刺激体内产生了何种物质还有待研究。

从本研究结果可见，金钗石斛雌配子和胚的发育有以下特点：子房为侧膜三心皮胎座，倒生型胚珠，蓼型胚囊，授粉后70 d，受精完成，受精卵分裂形成原胚，胚的发育为石竹型。授粉后150 d，种胚发育为圆球形胚，授粉后180 d，种子成熟。金钗石斛种子内外种皮分别由胚珠时期的内外珠被发育形成，由于珠被细胞的脱水皱缩，在内珠被和外珠被之间形成空气腔。

兰科植物种类繁多，不同种类之间内珠被的发育存在较大差异。五唇兰(Doritispulcherrima)[13]、古德兜兰(Paphiopedilumgodefroyae)[14]、墨兰(Cymbidiumsinense)[15]等在胚发育过程中内珠被退化消失，成熟时仅有外珠被发育而成的单层外种皮；在大花杓兰(Cypripediummacranthos)[16]、台湾杓兰(C.formosanum)[17]、扇脉杓兰(C.japonicum)[18]、无距虾脊兰[7]的研究中发现成熟种子具有内外双层(珠被)种皮，内珠被在种子发育成熟时形成一层致密的干膜质结构紧贴于胚，并认为这是导致成熟种子萌发困难的原因，这是种子对恶劣自然环境的一种保护性适应，可以避免种子过早萌发而受到严酷外界条件的伤害而死亡，但在无菌播种时会成为一种障碍。在本研究中发现，成熟的金钗石斛种子也有一层由内珠被发育而成的致密干膜质结构，但金钗石斛成熟种子不存在萌发困难的现象，而且种子成熟度越高，萌发率也越高[19]，所以内珠被的存在，不应该成为判断成熟种子是否容易萌发的依据。