李小凤，胡渤洋，陈青君，徐诗毅，王秋颖，张国庆*

(1.北京农学院 生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206; 2.北京农学院 植物科学技术学院/北京林木分子设计育种高精尖创新中心/农业 应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

蛹虫草[Cordycepsmilitaris(L.) Link]是子囊菌门、核菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属的模式物种。蛹虫草是一种食药兼用真菌，其子实体富含虫草素、虫草酸、虫草多糖等，具有抗肿瘤、抗氧化、降血压等活性，媲美传统中药冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)[1-3]。蛹虫草人工栽培始自20世纪80年代，经不懈努力，栽培技术成熟、操作简单，已在全国广泛种植[4]。而冬虫夏草生长条件苛刻，迄今尚未大规模商业化栽培。

菌种退化是蛹虫草人工栽培中常见的问题。随着继代培养，菌株活力下降、子实体产量下降甚至绝产，是制约蛹虫草栽培的最突出问题之一。较正常菌株，退化菌株在遗传性状和分子水平均表现出差异，如菌丝生长速率下降、子实体异常、交配型基因偏分离、基因突变频率升高等[5-7]。蛹虫草菌种退化使优良性状无法保持，给栽培产业带来了风险。因此，解决菌种退化问题成为国内外蛹虫草研究的重要问题之一。

交配型基因(Mating-type genes, MAT)是控制真菌有性生殖的关键因子。蛹虫草是二极性异宗配合型子囊真菌，存在两类不同源的交配型MAT1-1(MAT-alpha)和MAT1-2(MAT-HMG)，其中MAT1-1包含2个连锁的交配型基因MAT1-1-1和MAT1-1-2，而MAT1-2只包含一个交配型基因MAT1-2-1。单一交配型基因菌株无法形成子实体或子座上不产生子囊壳[8-10]。基因缺失和互补突变研究表明，缺失MAT1-1-1时，导致子座不育(不产生子囊壳与子囊孢子)；缺失MAT1-1-2时，虽能产生与亲本相似的子座，但子囊壳败育；缺失MAT1-2-1时，不能够形成子座[10]。能够出菇的蛹虫草菌株通常含有MAT1-1和MAT1-2两个交配型，而退化的菌株只含有MAT1-1或MAT1-2单一交配型[11]。而单交配型的子囊孢子菌株或分生孢子菌株，可通过杂交的手段，产生子实体，被认为是蛹虫草菌种复壮和选育的重要途径[12-14]。

本研究以能够正常出菇的蛹虫草CM1901菌株新鲜子实体为材料，采用单孢分离的方法获得子囊孢子单孢菌株，并进行交配型基因鉴定，为进一步开展蛹虫草复壮和优质高产菌株选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

蛹虫草CM1901菌株，由北京农学院植物科学技术学院食药用菌室分离并保存。

1.2 培养基和试剂

孟加拉红培养基，用于单孢分离培养；PDA培养基，用于单孢菌株保存。

菌丝体总DNA提取利用新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根，北京)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 单孢分离与培养

单孢分离采用梯度稀释涂布法。无菌条件下，采集无菌培养的蛹虫草CM1901菌株新鲜成熟子座，悬挂于无菌三角瓶中过夜，待孢子充分弹射后撤去子座，以无菌去离子水充分洗涤三角瓶瓶壁，收集弹射的子囊孢子。孢子悬液以无菌去离子水梯度稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等梯度。选取10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释液，涂布孟加拉红平板，25 ℃避光培养2～3 d，平板上即可获得子囊孢子萌发后刚刚肉眼可见的菌落。选择不交叉不重叠的单孢子萌发菌落，转接至PDA平板上继续25 ℃避光培养，待纯培养菌落直径达到1元硬币大小，转入新的PDA平板培养用于交配型基因鉴定，或转入PDA斜面培养并保存。

1.4 引物设计

根据NCBI的GenBank数据库中的蛹虫草交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1序列，分别设计3个交配型基因的特异性引物(表1)。

表1 PCR引物列表Tab.1 List of PCR primers

1.5 交配型基因鉴定

1.5.1 DNA提取 菌丝体总DNA提取以刚长满平板的新鲜菌丝体为材料，使用基因组DNA提取试剂盒(天根)提取。

1.5.2 退火温度优化 以亲本菌株菌丝体总DNA为模板，设定温度梯度优化PCR条件。PCR反应体系：基因组DNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃预变性30 s，50.0～57.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共35个循坏，72 ℃ 10 min。PCR结束后，产物利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5.3 PCR扩增与测序分析 根据1.5.2优化条件，以无菌水为阴性对照、CM1901亲本菌株为阳性对照，测定各单孢菌株交配型基因。分别回收亲本菌株和各单孢菌株的PCR产物，由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。目标序列利用NCBI在线BLAST比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

2 结果与分析

2.1 单孢分离与培养

通过梯度稀释法，挑选出不交叉、不重叠的单孢子接种到备好的PDA培养皿中培养，最终获得102株单孢菌株，分别编号为CMSS01-CMSS102。

2.2 退火温度优化

采用梯度PCR确定蛹虫草CM1901菌株亲本交配型基因的最适PCR退火温度范围，电泳结果如图1所示。MAT1-1-1交配型基因最适退火温度范围为54.3～57.0 ℃(图1-A)，MAT1-1-2交配型基因最适退火温度范围为54.0～55.0 ℃(图1-B)，MAT1-2-1交配型基因最适退火温度为57.3 ℃(图1-C)。单孢菌株交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1克隆时，退火温度分别选用55.0、55.0和57.0 ℃。

2.3 亲本菌株交配型基因鉴定

回收蛹虫草CM1901亲本交配型基因的清晰目标条带PCR产物，进行测序和在线BLAST比对分析。分别获得交配型基因MAT1-1-1、MAT1-1-2和MAT1-2-1部分序列，长度分别为422、888和785 bp，经在线BLAST比对分析，与蛹虫草MAT1-1-1 (KP721263.1)、MAT1-1-2 (XM_006072440.1)和MAT1-2-1 (AB084257.1)相似性分别为100%、100%和98.61%。表明获得的目标片段为蛹虫草交配型基因。

2.4 单孢子菌株交配型基因鉴定

分别测定102株单孢分离菌株的3种交配型基因类型，部分菌株电泳图谱如图2所示。结果表明，102个单孢菌株根据其交配型基因类型分为3类，即仅含MAT1-1交配型、仅含MAT1-2交配型、同时含有MAT1-和MAT1-2交配型(即亲本型)。仅含MAT1-1交配型菌株57株，仅含MAT1-2交配型菌株24株，另外21株为亲本型，MAT1-1∶MAT1-2为78∶45(表2)。另外，这3类单孢菌株表现出不同的菌落特征(图3)。MAT1-1交配型和亲本型菌株菌落存在同心圆结构，并产黄色色素；而MAT1-2交配型菌株菌落纯白，无同心圆结构和明显色素分泌。

表2 蛹虫草CM1901亲本与子囊孢子单孢菌株交配型基因类型

3 讨 论

蛹虫草、羊肚菌等子囊真菌类食用菌普遍存在菌株退化现象，组织分离菌株随着继代培养菌株活性和产量下降。为解决蛹虫草退化问题，前人从杂交育种、交配型基因等角度开展了大量研究。高新华对蛹虫草进行子囊孢子单孢分离，并通过两两杂交和子实体诱导，确定蛹虫草属于二极性异宗配合[15]。本研究以能够正常出草的蛹虫草CM1901新鲜子实体为材料，采用孢子弹射和梯度稀释培养法，获得102株子囊孢子单孢菌株。分别测定亲本和单孢菌株交配型基因MAT1-1(包括MAT1-1-1和MAT1-1-2)和MAT1-2，结果显示亲本菌株同时含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因(即亲本型)，而子囊孢子菌株存在仅含MAT1-1、仅含MAT1-2和亲本型3种类型。汪虹等分别鉴定了3株蛹虫草正常出草菌株和11株不出草的退化菌株是交配型基因，3株正常菌株同时含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因，而退化的11株菌株中，1个菌株缺失MAT1-1，10个菌株缺失MAT1-2[11]。但随着后续研究深入也发现，仅含有单一交配型的菌株也能够形成子实体。Zheng等报道，野外采集的18个蛹虫草菌株中，只有3个菌株同时含有MAT1-1和MAT1-2交配型基因[8]。基因缺失和互补突变研究表明，当缺失MAT1-2-1时不能形成子实体，而缺失MAT1-1-1或MAT1-1-2则不产生子囊壳或者子囊壳败育[10]。

尽管蛹虫草是二极性异宗配合型子囊真菌，但研究显示，无论是子囊孢子单孢菌株还是分生孢子单孢菌株，其MAT1-1和MAT1-2基因交配型比例往往达不到理论值1∶1，且不同菌株存在较大差异。谭琦等对蛹虫草栽培亲本菌株及其100株分离自菌丝的分生孢子交配型基因鉴定，亲本菌株同时含有MAT1-1和MAT1-2；100株单孢菌株中，40株只含有MAT1-1、25株只含有MAT1-2，35株为亲本型；MAT1-1∶MAT1-2为75∶60[16]。鲍大鹏从蛹虫草CM-H07菌株分离60株分生孢子单孢菌株，其中21株只含有MAT1-1、16株只含有MAT1-2，23株为亲本型；MAT1-1∶MAT1-2为44∶39[17]。Zheng等以同时含有MAT1-1和MAT1-2交配型的亲本菌株子实体为材料，分离获得30株子囊孢子单孢菌株，其中只含有MAT1-1和MAT1-2的菌株分别为28株和2株，亲本型菌株为0，MAT1-1∶MAT1-2为28∶2[8]。另外，Zhang和Liang报道，蛹虫草野生型和人工栽培菌株子囊孢子单孢菌株中，MAT1-1∶MAT1-2分别为66∶70和71∶60，接近理论值1∶1[12]。本研究结果中，CM1901菌株为同时含有MAT1-1和MAT1-2的亲本型菌株；102个子囊孢子单孢菌株中，57株只含有MAT1-1、24株只含有MAT1-2，21株为亲本型；MAT1-1∶MAT1-2为78∶45，高于Zhang和Liang报道的66∶70和71∶60[12]，但低于Zheng等报道的28∶2[8]。另外，还存在不含有MAT1-2的野生型和人工栽培菌株[8]。基于此，蛹虫草不是典型的二极性异宗配合型子囊真菌，在不同菌株中MAT1-1∶MAT1-2比例不同，这可能是由于MAT1-2基因改变或菌株自身差异。推测，随着蛹虫草继代培养，MAT1-2基因逐渐缺失，从MAT1-1∶MAT1-2理论比例1∶1直至不含MAT1-2基因。

本研究中，蛹虫草单孢分离时，不仅仅获得了只含MAT1-1或MAT1-2的交配型基因，同时还获得了同时含有MAT1-1和MAT1-2的亲本型菌株。高新华分别从C.m.H-07ZY1和C.m.H-04G13s9菌株子实体分离获得9个和11个子囊孢子单孢菌株，其中各有1株为亲本菌株，作者推测可能是由于将异核菌丝误认为子囊孢子单孢菌株[15]。另一方面，谭琦、鲍大鹏等在分离分生孢子单孢菌株时，获得了大量的亲本型单孢菌株[16,17]。而周春影等报道，台湾线虫草(Ophiocordycepsformosana)子囊孢子单孢菌株的亲本型菌株高于单一交配型，在分离获得34株子囊孢子单孢菌株中，14株只含有MAT1-1、2株只含有MAT1-2，16株为亲本型[18]。因此，在进行蛹虫草子囊孢子或者分生孢子单孢菌株分离时，亲本型单孢菌株普遍存在。类似的现象在双孢蘑菇担孢子中存在，一般担子菌每个担子顶端产生4个单核担孢子，而双孢蘑菇则产生2个双核、异核担孢子，并以此得名“双孢”。推测在蛹虫草子囊孢子形成过程中，有一定比例形成双核、异核子囊孢子，从而出现亲本型单孢菌株现象。这种亲本型单孢菌株有待通过显微观察等手段进一步研究。