刘 丹，王 朕，王 婉，刘 杰，曹 硕，李秋明*，沈 红*

(1.北京农学院 动物科学技术学院，北京102206; 2.北京市朝阳区王四营地区社会保障事务所， 北京 100023；3.北京大学 口腔医学院口腔医疗器械检验中心，北京100081)

鸡球虫病是集约化养殖中常见的且危害性极大疾病之一，防治鸡球虫病成为集约化养殖业中的棘手问题[1]。球虫感染后寄生于鸡消化道，不仅会降低日增重、料重比，严重影响生长性能，而且极易产生免疫应激，引起免疫器官功能障碍及免疫功能降低等[2]。目前，通常使用抗球虫药及疫苗来防治鸡球虫病，但疫苗预防存在安全性问题，抗球虫药又有耐药性且药物残留给食品安全带来影响。研究发现在饲料中添加中药对鸡球虫病防治起到良好疗效，如在日粮中添加槟榔提取物减少鸡粪便卵囊排出数，缓解感染球虫后鸡盲肠结构损伤，提高机体免疫力[3]。还有研究报道将鸦胆子醇提物添加到鸡日粮中有效的控制鸡血便的产生，降低病鸡盲肠的病变程度及卵囊排出量，且感染鸡的体质量增重未受影响[4]。研究认为中药中一些有效成分能够调节机体免疫功能缓解球虫对鸡的损伤，从而起到治疗鸡球虫病的效果[5]。大量研究表明，一些生物活性肽具有调节免疫的功能，如鹿茸蛋白肽可促进 RAW264.7细胞增殖，抗菌肽Api-PR19添加在饲粮中能改善鸡肠道绒毛形态结构和sIgA分泌，保护盲肠免受病原微生物侵害[6,7]。古医籍记载地鳖有破血散瘀，消肿，接骨续筋，修复骨，止血等功效，现代药理研究表明地鳖有效成分具有抗肿瘤、保护心脑血管系统、抗氧化抗衰老、免疫调节等作用[8]。中药大辞典中记载蛴螬可治疗白血病、肿瘤、喉癌等疾病，还可破血逐疲、明目退翳。研究表明，蛴螬具有显著的调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和抗病毒及抗菌的功效[9]。

试验研究利用地鳖肽和蛴螬肽的免疫调节作用，在仔鸡饲料中添加地鳖肽和蛴螬肽提取物，探讨多肽提取物对肉仔鸡感染柔嫩艾美耳球虫后的生长性能、抗球虫效果和调节免疫功能的影响，目的为进一步探究中药提取物代替兽药在缓解家禽疾病中的应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

RPMI-1640培养基购于美国HyClone公司，胎牛血清(FBS)购于法国Biowest公司，噻唑蓝(MTT)、伴刀豆球蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)购于美国Sigma公司，酶标板购自美国 Corning公司，细胞培养板、载玻片购于美国Costar公司，多聚甲醛、苏木素、伊红购自北京索莱宝科技有限公司，二甲苯购于北京博尔优生物技术有限公司；盐霉素(98%)购自厦门华生堂药业有限公司，柔嫩艾美耳球虫由北京农学院寄生虫实验室馈赠，地鳖多肽和蛴螬多肽冻干粉由北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室提供。

CO2恒温细胞培养箱购于日本SANYO公司，洁净工作台购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂，低温离心机购于德国Eppendorf公司；XSZ-D2 倒置生物显微镜购于北京索来宝科技有限公司，Infinite 200 Pro型酶联免疫检测仪购于瑞士TECAN公司，脱水机包埋机RM2135 型石蜡切片机德国LEICA 公司。1日龄仔鸡购自北京富佳种禽中心。

1.2 方 法

1.2.1 仔鸡分组及处理 选取健康1日龄仔鸡180只，随机分为6组，每组10只，各组设3个重复。阴性对照组和阳性对照组(即球虫感染组)仔鸡饲喂基础饲粮，盐霉素组在基础日粮中添加盐霉素(60 mg/kg)，地鳖肽、蛴螬肽和联合肽组在基础饲粮中分别添加地鳖肽(100 mg/kg)、蛴螬肽(100 mg/kg)、地鳖肽和蛴螬肽联合(1∶1)。除阴性对照组外，所有14日龄仔鸡感染球虫，每只鸡攻毒5×103个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，阴性对照组鸡给等量体积生理盐水。鸡以笼养方式及玉米-豆粕型粉状饲粮饲喂，基础饲粮配方参照NRC(1994)和鸡的饲养标准(NY/T 33—2004)配制，试验期为21 d。

1.2.2 仔鸡生长性能的测定 仔鸡试验前称仔鸡初始体质量，每天称空腹仔鸡体质量，分别计算仔鸡平均日增质量(ADG)、平均日采食量(Average daily feed intake)及料质量比(F/G)。

1.2.3 仔鸡抗球虫效果的测定 肉鸡盲肠病变：取21 d仔鸡盲肠，肉眼观察盲肠病变，依据盲肠病变计分标准[10]，记录病变值。病变值=各组平均病变计分×10。

卵囊排出数：收集仔鸡感染球虫后第4～7 天全粪，统计每克粪便卵囊数(OPG)。

抗球虫指数：按照文献[11]计算药物抗球虫指数(ACI)。

1.2.4 仔鸡空肠肠道形态及肠道上皮内淋巴细胞数的测定 取21 d仔鸡空肠中段，参照文献[12]制作石蜡切片，测小肠绒毛高度(V)、隐窝深度(C)及二者比值(V/C)，计数每100个黏膜上皮淋巴细胞数(IEL)。

1.2.5 仔鸡免疫器官指数的测定 取21 d仔鸡称质量，采血后处死剖腹剪取法氏囊、胸腺、脾脏称质量，按公式计算：脏器指数=脏器质量/活鸡体质量。

1.2.6 仔鸡外周血淋巴细胞转化率的测定 取21 d仔鸡静脉无菌采血，参照文献[13]分离和制备外周血淋巴细胞，细胞计数后取100 μL淋巴细胞悬液和100 μL RPMI1640完全培养基置于96孔细胞板内培养，T 淋巴细胞组每孔加Con A，B 淋巴细胞组每孔加LPS，将培养板放置 37 ℃ 5% 二氧化碳培养箱培养48 h，采用MTT法检测淋巴细胞转化率。

2 结 果

2.1 多肽提取物对仔鸡生长性能及脏器指数的影响

试验仔鸡饲养至21日龄其生长性能情况见表1，盐霉素、地鳖肽、蛴螬肽组仔鸡料重比、平均日增重和日采食量与阳性对照组相比差异均不显著。仔鸡免疫器官指数分析，结果与阴性对照组相比，阳性对照组均极显著降低了21日龄肉仔鸡脏器指数(脾脏、法氏囊及胸腺)(P<0.01)；与阳性对照组相比，盐霉素组均极显著升高了21日龄肉仔鸡脏器指数(脾脏、法氏囊及胸腺)(P<0.01)；21日龄肉仔鸡地鳖肽、蛴螬肽和联合肽组均极显著升高了肉仔鸡脏器指数(脾脏、胸腺及法氏囊)(P<0.01)(图1)。

表1 多肽提取物对仔鸡生长性能、盲肠损伤和卵囊排出数的影响Tab.1 Effects of polypeptide extracts on the growth performance, intestinal damage and the numbers of oocyst excretion from broilers

2.2 多肽提取物对仔鸡抗球虫效果的影响

由表1知阳性对照组肠道损伤评分为3.17，盐霉素、地鳖肽、蛴螬肽和联合肽组分别为1.33、2.17、1.83、1.83，结果表明多肽提取物显著降低感染球虫的仔鸡的肠道损伤。阳性对照组卵囊排出数达到11.95×104，而盐霉素、地鳖肽、蛴螬和联合肽组均低于5.76×104，结果说明多肽提取物显著降低卵囊排出数及呈现一定的抗球虫效果。阳性对照组抗球虫指数(ACI)为126.44，盐霉素组为179，地鳖肽、蛴螬肽和联合肽组分别为157.81、159.58和159.79，结果显示多肽提取物抗球虫效果为中效。

2.3 多肽提取物对仔鸡肠道结构及肠黏膜形态的影响

仔鸡肠道结构变化见图2，与阴性对照组相比，阳性对照组肠绒毛明显变宽变短且隐窝深度变高；盐霉素组和多肽组与阳性对照组相比，绒毛宽度有所改善，绒毛高度基本恢复正常且绒毛深度变低。通过显微镜观察及计算机分析仔鸡空肠绒毛高度和隐窝深度，结果阳性对照组与阴性对照组相比仔鸡空肠绒毛高度极显著降低，隐窝深度极明显升高，绒毛高度/隐窝深度值极显著降低；与阳性对照组相比，盐霉素、地鳖肽、蛴螬肽、联合肽组仔鸡空肠绒毛高度均极显著提高，隐窝深度极显著降低，V/C比值明显提高(表2)。

2.4 多肽提取物对仔鸡空肠淋巴细胞数及外周血淋巴细胞转化的影响

球虫感染仔鸡的空肠上皮内淋巴细胞数量(IEL)如表2所示，阴性对照组鸡肠道上皮淋巴细胞数量为11.45，阳性对照组IEL数量为13.26，地鳖肽、蛴螬肽和联合肽组鸡球感染虫后IEL数分别达到22.74、21.79和24.39，比阳性对照组分别提高71%、64%和83%，且联合肽组IEL数量增加最多。与阴性对照组相比，阳性对照组仔鸡外周血B淋巴细胞转化率差异不显著但有降低趋势，T淋巴细胞转化率显著降低；与阳性对照组相比，盐霉素组仔鸡外周血B淋巴细胞转化率差异不显著，但地鳖肽、蛴螬肽和联合肽组T和B淋巴细胞转化率均极显著升高(表2)。

表2 多肽提取物对球虫感染仔鸡空肠肠黏膜形态、空肠上皮内淋巴细胞及外周血淋巴细胞转化的影响Tab.2 Effect of polypeptide extracts on jejunal intestinal morphology, jejunal intraepithelial lymphocytes and theperipheral blood lymphocyte transformation of the broiler infected with chicken coccidia

3 讨 论

鸡球虫病是集约化鸡养殖业中十分严重的寄生虫病，感染鸡球虫病后鸡的生长性能、免疫功能及肠道屏障均会发生异常，但很多研究发现在日粮中添加生物活性肽可以提高鸡体各项机能。有研究报道[14]在日粮中添加蚯蚓肽可以提高鸡的日增重，料重比降低，这是鸡生长性能的重要指标。试验研究在日粮中添加多肽提取物仔鸡的日增重、料重比影响不明显，究其原因可能饲养过程中未能保证每只仔鸡能吃到足够日粮，造成个别鸡采食量少，日增重缓慢，料重比受到影响。免疫器官指数和淋巴细胞转化率可以反映免疫功能，免疫器官的指数和淋巴细胞转化率越高，机体免疫机能会越好[15]。研究报道，日粮中添加天蚕素抗菌肽可以明显提高817肉杂鸡的免疫器官指数，显著升高T淋巴细胞转化率[16]。试验本研究结果日粮中添加多肽提取物肉仔鸡外周血淋巴细胞转化率、免疫器官脏器指数明显提高，这与前人报道一致，结果提示多肽物可提高球虫感染仔鸡的免疫调节作用。

柔嫩艾美耳球虫病防治过程中，盲肠的损伤情况以及粪便中卵囊排出数量是检验防治效果的重要指标，卵囊排出数量和肠道损伤评分越低，表示药物抗球虫效果越佳，从而判断出药物的抗球虫指数越高[5]。试验研究中联合肽组仔鸡排出卵囊数和肠道损伤明显低于阳性对照组(球虫感染组)，而ACI高于球虫感染组但低于抗球虫药盐霉素组，结果表明多肽提取物有一定抗球虫作用。鸡的肠道具有消化和吸收营养成分及抵抗外界病原体侵害的作用，当肠道绒毛高度变低或隐窝变深时，表示肠道黏膜形态出现损害情况，当绒毛高度与隐窝深度之比降低时，表示肠道黏膜已受到损伤且消化吸收能力出现异常，严重时会造成动物的免疫功能下降，反之则表明肠道免疫及吸收功能完好[17]。试验结果在日粮中添加多肽提取物后球虫感染仔鸡肠道绒毛高度增加，隐窝深度降低，绒毛高度/隐窝深度值升高，提示多肽提取物可改善球虫感染的鸡肠道形态和肠道吸收能力。

综上所述，日粮中添加多肽提取物(地鳖肽和蛴螬肽)具有一定的抗球虫效果，可能通过提高机体调节免疫功能降低鸡球虫感染造成的应激反应，改善肠道形态而降低肠道损伤。