牛思 樊宏伟 倪猛

(南阳市中心医院消化内科一病区，河南 南阳 473000)

胰腺癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤〔1〕，具有高发病率和致死率的特点。据统计，胰腺癌患者的预后是所有人类癌症中最差的，致死率与发病率的比值约为0.992〔2〕，5年存活率仅为8%〔3〕。据推测，在欧美等国家胰腺癌将在2030年上升至导致人类死亡率增加的第二大肿瘤〔2〕。胰腺癌在我国发病率和致死率呈逐年上升趋势〔4〕。放射是目前有效治疗胰腺癌的方法之一，可提高胰腺癌患者的转移率、生存率，然而放疗抵抗是导致胰腺癌临床治疗失败的主要原因〔5〕，如何提高胰腺癌患者的放射敏感性是目前临床治疗的主要瓶颈。微小RNA(miRNA)是一种高度保守型的非编码小RNA，在细胞的生长、分化、凋亡、自噬等过程中发挥关键作用〔6，7〕。miRNA在肿瘤中的异常表达与肿瘤的产生相关，通过发挥癌基因或抑癌基因的作用参与恶性肿瘤的发生发展。研究发现，microRNA-206(miR-206)在胰腺癌中表达量异常，且可通过调控细胞增殖、侵袭及淋巴管生成等参与胰腺癌的发生、发展〔8〕。但目前关于miR-206对胰腺癌细胞放射敏感性的相关研究较少，本研究旨在探讨miR-206对胰腺癌细胞放疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器 胰腺癌细胞系(AsPC-1、Capan-2、PL45、PANC-1)购自中科院上海细胞所；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自美国HyClone公司；Lipofectamine 2000、逆转录试剂盒购自美国Thermo公司；青霉素、链霉素、甲醇、Trizol试剂购自美国Sigma公司；细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；序列相似性家族83成员(FAM83)A野生型(FAM83A-WT)及FAM83A突变型(FAM83A-MUT)双荧光素酶报告基因、pcDNA-FAM83A、miR-206 mimics、anti-miR-206及相应的阴性对照均购自上海吉玛生物有限公司；兔抗细胞周期蛋白(Cyclin)D1抗体、鼠抗FAM83A抗体、羊抗二抗购自美国Abcam公司，鼠抗β-catenin抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；细胞培养箱、酶标仪、流式细胞仪购自美国Thermo公司；7500荧光定量聚合酶链反应(qPCR)仪购自美国ABI公司。

1.2细胞的培养和分组 胰腺癌细胞系(AsPC-1、Capan-2、PL45、PANC-1)培养于含有10%FBS和1%双抗的DMEM培养基，置于相对湿度为95%、CO2浓度为5%的37℃恒温培养箱中培养，观察细胞密度至70%～80%时加入0.25%胰酶消化处理，1∶4进行传代。选取生长状态良好的细胞进行培养，随机分为miR-NC组(转染阴性对照NC质粒)、miR-206组(转染miR-206 mimics从而过表达miR-206)、anti-miR-NC组(转染阴性对照anti-NC质粒)、anti-miR-206组(转染anti-miR-206从而敲低miR-206)、miR-206+pcDNA组(共转染miR-206 mimics和阴性对照pcDNA)、miR-206+FAM83A组(共转染miR-206 mimics和过表达FAM83A质粒pcDNA FAM83A)。

1.3qPCR实验 使用Trizol提取细胞中总RNA，通过cDNA合成试剂盒将RNA样本转变为cDNA。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算miR-206/FAM83A mRNA的相对表达水平。其中，miR-206的上游引物为5′-CAGATCCGATTGGAATGTAAGG-3′，下游引物为5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3′；FAM83A的上游引物为5′-CCCATCTCAGTCACTGGCATT-3′，下游引物为5′-CCGCCAACATCTCCT TGTTC-3′；GAPDH上游引物为5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′，下游引物为5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′。

1.4细胞的转染 选取状态良好的PANC-1细胞，制备细胞单悬液，并调整细胞浓度为1×105个/ml，吸取100 μl细胞悬液至12孔板，37℃、5%CO2培养箱培养。培养基更换为Opti-MEM溶液，准备A液(miR-206 mimics/anti-miR-206、pcDNA FAM83A与50 μl Opti-MEM溶液混匀)；准备B液(2 μl Lipofectamine 2000与50 μl Opti-MEM溶液混匀)；A液和B液混匀后加入每孔PANC-1细胞中，37℃培养箱培养4～6 h，培养基更换为DMEM继续培养。

1.5细胞克隆实验 接种生长状态良好PANC-1细胞至6孔板中，37℃过夜培养，待其贴壁后使用2 Gy强度的X射线进行照射，源靶距100 cm，照射野为10 cm×10 cm，剂量为2 Gy，剂量率为2.59 cGy/h，射野覆盖全细胞培养板;加入3 ml培养基，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养7 d。待细胞生长出肉眼可见克隆，终止培养，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，加入甲醇溶液固定20 min，晾干，使用0.1%结晶紫染色40 min，自来水洗去染色液，晾干，显微镜观察计数。

1.6流式细胞术实验 收集放疗后的各组细胞，预冷PBS冲洗3次，取大约5×105个细胞用于凋亡检测，加入500 μl结合缓冲液、5 μl 膜联蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)、5 μl 碘化丙啶(PI)混匀，室温条件下避光孵育15～20 min，使用流式细胞仪检测凋亡情况。

1.7双荧光素酶报告基因实验 使用Targetscan预测miR-206和FAM83A靶向结合位点；设计并合成野生型FAM83A-WT-3′UTR和突变型XIAP-MUT-3′UTR片段，将其插入荧光报告质粒下游；将PANC-1细胞接种至24孔板中，待细胞密度约80%，与miR-206mimics、anti-miR-206或NC质粒进行共转染，孵育24 h，加入适量细胞裂解液，振荡20 min，加入底物，检测荧光素酶的活性，验证miR-206和FAM83A的靶向关系。

1.8Western印迹 取稳定转染的PANC-1细胞系，加入RIAP裂解液，冰上裂解30 min，离心，收集上清，使用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量，10%浓度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后将目的条带转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%的牛奶溶液封闭2 h，TBST洗膜3次，加入FAM83A(1∶1 000)、β-catenin(1∶200)、CyclinD1(1∶500)、GAPDH一抗(1∶1 000)过夜孵育，TBST清洗3次，加入二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBST清洗3次。晾干，加入电化学(ECL)发光液于暗室曝光、显影，Image J软件检测目的蛋白灰度值。

1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-206在胰腺癌细胞系中的表达量 与人正常胰腺上皮细胞(HPNE)miR-206水平(1.00±0.05)相比，miR-206在胰腺癌AsPC-1、Capan-2、PL45、PANC-1细胞系中的表达量〔(0.79±0.06)、(0.70±0.06)、(0.56±0.04)、(0.37±0.03)〕均显著降低(P<0.05)，其中miR-206在胰腺癌PANC-1细胞表达量最低，因此选取PANC-1细胞作为后续实验对象。

2.2过表达miR-206对胰腺癌细胞放疗敏感性的影响 miR-206组细胞中miR-206表达量显著高于miR-NC组(P<0.05)；miR-206组凋亡率显著高于miR-NC组(P<0.05)，增加胰腺癌细胞放疗敏感性。见图1，表1、表2。

图1 过表达miR-206对PANC-1细胞存活率、凋亡的影响

表1 过表达miR-206对PANC-1细胞凋亡的影响

表2 单击多靶模型的参数值

2.3miR-206与FAM83A靶向关系的验证 经在线软件Targetscan预测结果见图2，miR-206和FAM83A 3′UTR区域具有较强的结合能力，推测FAM83A可能是miR-206的靶基因之一。双荧光素酶报告基因进一步检测结果见表3，当过表达miR-206时，共转染野生型FAM83A双荧光素酶报告载体的细胞相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，但共转染突变型FAM83A双荧光素酶报告载体的细胞相对荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)；敲低miR-206表达量时，共转染野生型FAM83A双荧光素酶报告载体的细胞相对荧光素酶活性显著提高(P<0.05)，但共转染突变型FAM83A双荧光素酶报告载体的细胞相对荧光素酶活性仍无显著变化(P>0.05)。

图2 miR-206和FAM83A靶向关系的验证

表3 双荧光素酶报告实验

2.4miR-206调控FAM83A的表达量 与HPNE细胞相比，FAM83A在胰腺癌多种细胞系中表达量显著增加(P<0.05)，见表4、图3A；miR-206组FAM83A蛋白(0.38±0.04)显著低于miR-NC组(1.00±0.09，P<0.05)；anti-miR-206组FAM83A蛋白(2.31±0.16)显著高于anti-miR-NC组(1.01±0.08，P<0.05)。见图3B。

表4 FAM83A在胰腺癌细胞系中的表达

A:1～5:HPNE组,AsPC-1组,Capan-2组,PL45组,PANC-1组;B:1～4:miR-NC组,miR-206组,anti-miR-NC组,anti-miR-206组图3 miR-206调控FAM83A的表达量

2.5共转染过表达miR-206和FAM83A对胰腺癌细胞放疗敏感性的影响 与miR-206+pcDNA组相比，共转染过表达miR-206和FAM83A显著增加FAM83A蛋白的表达量，miR-206+FAM83A组凋亡率显著低于miR-206+pcDNA组(P<0.05)。降低胰腺癌细胞放疗敏感性。见图4，表5，表6。

1～2：miR-206+pcDNA组,miR-206+FAM83A组

图4 共转染过表达miR-206和FAM83A对胰腺癌细胞放疗敏感性的影响

表5 共转染过表达miR-206和FAM83A对胰腺癌的影响

表6 单击多靶模型的参数值

2.6共转染过表达miR-206和FAM83A对Wnt/β-catenin通路的影响 与miR-NC组相比，过表达miR-206显著降低β-catenin蛋白及CyclinD1蛋白的表达量(P<0.05)；与miR-206+pcDNA组相比，共转染过表达miR-206和FAM83A显著增加β-catenin 以及CyclinD1蛋白的表达量(均P<0.05)。见图5，表7。

1～4：miR-NC组，miR-206组，miR-206+pcDNA组，miR-206+FAM83A组图5 共转染过表达miR-206和FAM83A对Wnt/β-catenin通路的影响

表7 共转染过表达miR-206和FAM83A对Wnt/β-catenin通路的影响

3 讨 论

miRNAs是一种具有高度特异性、保守性的非编码RNA，通过与下游蛋白编码基因结合，阻碍其翻译或降解靶mRNA，从而抑制靶蛋白的表达量〔9〕。研究表明，miRNAs在多种肿瘤中表达量异常，并与肿瘤细胞的生物学行为相关，其中包括放射抵抗〔10〕。miR-206被报道在乳腺癌组织中表达量显著降低〔11〕，可通过靶向调控VEGF的表达量阻碍喉癌细胞侵袭、迁移能力〔12〕，是一种横纹肌肉瘤的潜在分子标志物〔13〕。Keklikoglou等〔8〕发现，miR-206在胰腺癌中参与细胞增殖、侵袭及淋巴管生成过程。结果提示过表达miR-206增加PANC-1细胞的放疗敏感性。在肿瘤中，miR-206对肿瘤细胞的放疗敏感性的相关研究已有报道，如miR-206可增强胶质瘤细胞的放疗敏感性，其主要通过靶向丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)1从而抑制MAPK信号通路发挥作用〔14〕。在鼻咽癌中，miR-206通过靶向类胰岛素生长因子(IGF)1增强鼻咽癌细胞的放疗敏感性〔15〕。上述研究结果均表明，miR-206可增强肿瘤细胞的放疗敏感性，与本实验结果一致，表明miR-206可作为提高肿瘤放疗敏感性的潜在分子靶位点，提高患者的预后。

FAM83A又叫BJ-TSA-9，位于染色体8q24。据报道，FAM83A在乳腺癌〔16〕、胰腺癌〔17〕等癌组织中表达量均显著上调，而在正常组织中几乎不表达，表明FAM83A在肿瘤发生发展中具有重要作用。在胰腺癌中，沉默FAM83A基因降低胰腺癌细胞成球数，诱导其凋亡，增强胰腺癌细胞的放疗敏感性，表明FAM83A是一种潜在的放疗抵抗的靶位点〔18〕。本研究表明miR-206与FAM83A表达量呈负反馈调节；miR-206可通过抑制FAM83A增强胰腺癌放疗敏感性。

Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤细胞增殖、凋亡、放疗敏感性等调控过程中具有重要的作用〔19〕。CyclinD1是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶蛋白，影响细胞增殖周期。当细胞质中β-catenin积累量增多时，增强细胞膜的通透性，促进β-catenin进入细胞核，提高靶基因CyclinD1水平，诱导肿瘤的发生、发展〔20〕。本研究结果表明miR-206靶向抑制FAM83A从而影响Wnt/β-catenin信号通路的活性，增强胰腺癌细胞的放疗敏感性，进一步提示miR-206可作为胰腺癌放射治疗的潜在靶点。