荣誉磊 周志林 赵冬兰 唐君 彭湘君 赵玉琪 宗凯 吕亚宁 姚改芳 胡康棣 张华

摘要：对甘薯、番茄、拟南芥中63个SPL基因家族进行了系统进化树分析、保守蛋白基序（Motif）分析，筛选归纳出同源性较高的2个分支的12个SPL基因进行理化性质分析、核定位预测等，氨基酸序列比对结果表明这些基因的功能可能较为保守。通过对番茄中的SPL基因Solyc05g015510.2、Solyc10g078700.1进行表达量分析，发现这2个基因可能参与调控果实成熟衰老进程。另外，通过对非生物胁迫下的转录水平进行分析得知，拟南芥中的AT5G43270可能参与对盐胁迫、热胁迫条件下的响应，AT1G27360、AT1G27370可能参与热胁迫条件下的响应，AT2G42200可能参与冷胁迫条件下的响应，而AT3G57920在非生物胁迫条件下表达量没有特别明显的变化，表明AT3G57920可能不参与非生物胁迫下的响应。

关键词：SPL转录因子家族;番茄;甘薯;拟南芥;生物信息学

中图分类号： S188  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）20-0074-10

收稿日期：2021-03-08

基金项目：国家重点研发计划（编号：2019YFD100070、2019YFD100071、2019YFD1001300、2019YFD1001303）;现代农业产业技术体系项目（编号：CARS-10-B1）;国家自然科学基金（编号：31670278、31970200、31970312、31901993、31872078）;安徽省科技重大项目（编号：16030701073）;中央高校基础研究基金（编号：JZ2018HGTB0241、JZ 20181）。

作者简介：荣誉磊（1992—），男，安徽阜阳人，硕士，研究方向为采后生物学。E-mail：990953597@qq.com。

通信作者：胡康棣，博士，副教授，研究方向为采后生物学，E-mail：kangdihu@hfut.edu.cn;张 华，博士，教授，研究方向为植物分子生物学，E-mail：hzhanglab@hfut.edu.cn。

植物基因转录水平的调控发生在基因表达的初期，是许多基因表达调控的主要方式。在此调控过程中，被称为转录因子的蛋白质特异结合到靶基因启动子，控制着一系列相关基因的表达[1-2]。squamosa promoter binding protein box（简称SBP-box）基因别称 squamosa promoter binding protein like（简称SPL）基因，可编码一类绿色植物特有的转录因子，调节多个不同并且重要的生物过程，如叶片发育[3]、调节细胞数量和大小[4]、花和果实的发育[5-9]、拟南芥花粉孢子的形成[10]和响应赤霉素（GA）信号[11]等。SPL基因最初是從金鱼草（Antirrhinum majus）中分离出来，人们把它命名为SBP1和SBP2，研究发现SPL蛋白通过结合MADS-box基因启动子的squamosa元件，控制植物花的早期发育。已知的SPL家族成员都具有高度保守的DNA结合结构域（SBP），大约含有76个氨基酸残基，具有2个典型的C3H（C—C—CH）和C2HC（C—C—H—C）锌指结构特征，其 C端区域具有核定位信号[12]，能介导SPL蛋白进入细胞核。SPL基因由不同数量的外显子组成，但所有陆地植物的SBP结构域都是由第一和第二外显子编码的，并且这2个外显子之间的内含子位置也是保守的[13]。SBP锌指遵循 CC—x—C—x—C—x—[HC]—x—C—x—C—x—H—x—C（x表示氨基酸）的一般模式，其他3种组氨酸都很保守，但不参与锌的结合[6]。此外，核磁共振技术（NMR）被用来研究拟南芥中SBP转录因子SPL4 和SPL7的DNA结合结构域[14]。体外试验表明，SBP锌指结构域优先结合序列-TNCGTACAA-[15]，然而，除了它们与DNA结合的能力之外，人们对这些潜在的转录调节因子的生理功能知之甚少。

自发现以来，SBP-box基因家族在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[16]、水稻（Oryza sativa）[17]、玉米（Zea mays）[18]、小麦（Triticum aestivum）[19]和番茄（Solanum lycopersicum）[20]等植物中均有报道。在拟南芥中，有11个SPL基因受 miR156 调控，已有文献报道miR156 通过转录切割以及翻译抑制来调节SPL3表达[21]，拟南芥AtSPL1基因能够参与植物发育和对伏马菌素B1的敏感性[22]。拟南芥SBP-box基因家族转录因子参与花期的转变，有报道阐明了它们在拟南芥发育中的作用，分析了可能的同源基因SPL9和SPL15的单突变体和双突变体表型，发现这些基因在控制生殖生长的转变过程中起着冗余作用。此外，在营养生长过程中，它们的功能缺失导致花序结构改变和分枝增强[23]。对LeSPL-CNR的研究表明，SBP-box基因在调控番茄果实成熟过程中起着重要作用，同时也证明了番茄的大量自然变异受表观遗传过程控制的论点[24]。部分SPL可通过调节其他转录因子来发挥功能，并且也能参与葡萄糖、无机盐和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成相关的代谢过程[25]。但是SPL基因家族在甘薯发育中的功能相关研究鲜有文献报道，在番茄和拟南芥中的基因功能研究也不是很全面，本研究运用生物信息学方法对甘薯、拟南芥、番茄中SPL家族成员理化性质、亚细胞定位、蛋白质基因序列分析、氨基酸序列比对、蛋白结构域及转录水平进行分析，并对可能参与的功能进行探讨，以期为进一步研究SPL基因在甘薯、番茄、拟南芥中的功能提供借鉴。

1 试验方法

1.1 SPL基因家族系统进化树分析与保守蛋白基序（motif）分析

从Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）网站下载拟南芥和番茄中已鉴定的33条SPL蛋白序列作为参考，其中拟南芥中16条，番茄中17条，利用甘薯网站（http：//sweetpotato.plantbiology.msu.edu）中蛋白序列数据库blastp 检索甘薯蛋白数据库获得30条候选序列。利用MEGA 7.0软件使用Neighbor-Joining法构建SPL家族蛋白的系统发育树，利用iTOL工具网站（http：//itol.embl.de/）对系统发育进化树进行优化。利用MEME网站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）对SPL蛋白基序（motif）進行分析。将得到的系统发育树与motif分析结果进行对比，找到同源性较高且系统发育树结果和motif分析结果吻合的SPL分支进行深入分析。

1.2 SPL基因家族理化性质分析与亚细胞定位预测

利用ExPASy网站（https：//web.expasy.org/protparam/）对2个同源性较高的分支中的12个SPL基因的序列长度、蛋白质等电点、分子量等理化参数进行分析，并利用核定位信号NLS Mapper工具（http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）预测蛋白质的核定位信号，随后通过 Cell-PLoc 2.0 预测了这12个蛋白质的亚细胞定位。

1.3 同源SPL蛋白结构域分析及氨基酸序列比对

将上述筛选得到的2个分支12个SPL基因利用SMART（http：//smart.embl.de/）网站分别进行蛋白结构域分析，并利用ESPript 3.0（https：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）网站进行氨基酸序列比对分析。

1.4 番茄中SPL基因表达量分析

将筛选得到的2个分支中番茄的SPL基因利用TomExpress（http：//tomexpress.toulouse.inra.fr/）网站，挖掘基因表达数据，并进行绘图和分析。

1.5 非生物胁迫条件下的拟南芥中SPL基因表达量分析

将上述筛选得到的2个分支中拟南芥中的SPL基因利用ePlant工具（http：//bar.utoronto.ca/eplant/）获取拟南芥中非生物胁迫条件下SPL基因的表达数据，并进行绘图和分析。

2 结果与分析

2.1 甘薯、番茄、拟南芥中SPL家族蛋白进化树与motif分析

将BLAST同源比对获得的63条SPL家族蛋白利用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。如图1所示，3个分支中，Solyc04g064470.1独自在一个分支中，表明较其他家族成员亲缘性较远，第2个分支中包括AT5G18830、Solyc01g080670.2、itf01g13650.t1，第3个分支包括其余甘薯、番茄、拟南芥中59个SPL基因。其中甘薯itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1与番茄Solyc05g015510.2以及拟南芥AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360在同一个分支，说明它们亲缘性较高，可能具有相似的基因功能。甘薯itf15g02920.t1、itf01g24210.t1与拟南芥AT2G42200、AT3G57920以及番茄Solyc10g078700.1在同一个分支，说明它们亲缘性较高，可能具有相似的基因功能。

随后，利用MEME网站分析甘薯、番茄、拟南芥中63个SPL家族蛋白的保守蛋白基序（motif）。由图2可以看到SBP-box 蛋白基序分布，不同颜色的方块代表不同基序。其中，itf05g01080t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1与Solyc05g015510.2以及AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的motif具有很大的相似性，这一点与基因家族进化树的结果相符合，另外，itf15g02920.t1、 itf01g24210.t1与AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1的motif结果也很相似，与进化树结果一致。

2.2 甘薯、番茄、拟南芥中SPL蛋白家族理化性质与亚细胞定位预测

通过对图2中保守性较高的2个分支中12个SPL基因核酸序列和氨基酸序列进行理化分析，结果（表1）表明，蛋白质编码区（CDS）序列长度为 1 038～1 392 bp，蛋白质编码序列为345～463个氨基酸残基，蛋白分子量为37 017.17～50 418.90 g/mol，等电点（pI）介于7.94～9.11之间。在蛋白质序列的整个区域内，对SPL蛋白的核定位信号序列（NLS）进行分析，通过 NLS Mapper 网站进行预测。如表1所示，5个拟南芥SPL基因中有3个含有潜在的 NLS，2个番茄SPL基因都没有含有潜在的NLS，5个甘薯SPL基因中只有1个含有潜在的 NLS，说明部分SPL蛋白可能在细胞核中发挥作用。

同时，利用Cell-PLoc 2.0 预测了这12个SPL家族蛋白的亚细胞定位。如表2所示，12个SPL家族蛋白均定位在细胞核内，值得注意的是其中有3个SPL家族蛋白也存在细胞质内。

2.3 SPL家族蛋白的结构域分析及氨基酸序列比对

对上述12个同源性较高的SPL基因进行结构域分析（图3），发现这12个基因都具有典型的SBP结构域，且第1个分支的SBP结构域的位置在第170～250个氨基酸，第2个分支的SBP结构域的位置在第50～160个氨基酸，说明这2个分支都具有保守的SBP转录因子结构域，但SBP结构域的位置明显不同。

通过对上述SPL基因进行氨基酸序列对比分析发现，itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1、Solyc05g015510.2、AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的序列之间具有差异性，然而均具有高度保守的SBP结构域（图4-a），保守的SBP结构域包括2个锌指结构和NLS，第2个锌指结构与NLS有重叠，itf15g02920.t1、itf01g24210.t1、AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1也具有高度保守的SBP结构域（图4-b），也具有2个锌指结构和1个NLS。该结构域富含半胱氨酸和组氨酸的基序，表明在分子层面这些基因也具有高度同源性。

2.4 番茄中SPL基因表达水平分析

分析番茄中2个的SPL基因表达量（图5）可知，Solyc10g078700.1在番茄组织中大部分时间表达量是处于一个较稳定的状态，然而在开花后4 d表达量急速增加，在开花后41 d及以后，表达量减少，这说明这个基因可能参与果实成熟过程中相关通路的途径。Solyc05g015510.2在其他组织中的表达量在0.04左右，但是在果实破色期到红熟期之间，基因表达量快速上升，这表明该基因可能参与果实成熟衰老的过程。

2.5 拟南芥SPL基因在非生物胁迫条件下的转录水平分析

筛选出来的12个SPL基因中，有5个拟南芥基因，在网站里检索这5个SPL基因在冷、热、干旱等胁迫下基因的表达量。如图6-A所示，AT5G43270在遭受盐胁迫、热胁迫0.5 h后幼苗中SPL基因表达量急速下降，在这之后的24h内呈上升趋势，有的甚至超过对照组，说明AT5G43270可能參与拟南芥对盐胁迫、热胁迫条件下的反应。图6-B 中AT1G27360在遭受热胁迫12 h后幼苗中SPL基因表达量急速上升，超过对照组，说明AT1G27360可能参与热胁迫条件下的响应。图6-C中AT1G27370在遭受热胁迫6 h后幼苗中SPL基因表达量急速上升，在8 h左右时超过对照组，说明AT1G27370可能参与热胁迫条件下的响应。而根中基因表达量与对照组相比，没有明显差异。由图6-D可知， 另外一个分支中的AT2G42200在冷胁迫条件下 12 h 后幼苗中SPL基因表达量急剧上升，说明AT2G42200可能参与冷胁迫条件下的响应，根中的SPL基因表达量在受到非生物胁迫时几乎没有变化。由图6-E可知，AT3G57920在非生物胁迫条件下表达量没有特别明显的变化，说明AT3G57920可能不参与非生物胁迫条件下的响应，根中的基因表达量在受到非生物胁迫时也几乎没有变化。

3 讨论

本研究利用BLAST同源比对，获得甘薯、番茄、拟南芥中的63个SPL家族蛋白，并进行进化树分析，结果表明甘薯itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1与番茄Solyc05g015510.2以及拟南芥AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360在同一个分支，这7个SPL基因虽然不在同一物种中，但是亲缘性较高。甘薯itf15g02920.t1、itf01g24210.t1与拟南芥AT2G42200、AT3G57920以及番茄Solyc10g078700.1在同一个分支，说明它们亲缘性较高。motif分析结果与基因家族进化树的结果相符合，进而归纳出2个SPL基因家族的分支，基因结构域分析发现这2个分支的12个SPL基因都具有典型的SBP结构域。

通过对上述12个SPL基因进行氨基酸序列的对比分析发现，其中含有itf05g01080.t1、itf08g18710.t1、itf13g017290.t1、Solyc05g015510.2、AT5G43270、AT1G27370、AT1G27360的分支序列之间虽然具有差异性，但是均具有高度保守的SBP结构域，保守的SBP结构域包括2个锌指结构和NLS，第2个锌指结构与NLS有重叠，itf15g02920.t1、itf01g24210.t1、AT2G42200、AT3G57920、Solyc10g078700.1也具有2个锌指结构和1个NLS。该结构域的相同结构表明在分子层面这些基因也具有结构同源性。

最后进行基因功能验证，表明Solyc10g078700.1这个基因可能参与果实成熟过程中相关通路的途径，Solyc05g015510.2这个基因可能参与果实成熟衰老的过程，拟南芥中AT5G43270可能参与拟南芥对盐胁迫、热胁迫条件下的反应，AT1G27360、AT1G27370可能参与热胁迫条件下的响应。而另外一个分支中可以看到，AT2G42200在冷胁迫条件下12 h后幼苗中SPL基因表达量上升，说明AT2G42200可能参与冷胁迫条件下的响应，AT3G57920在非生物胁迫条件下表达量没有特别明显的变化。本研究初步筛选了甘薯、番茄、拟南芥中的SPL基因，并利用生物信息学方法对理化性质、亚细胞定位预测、蛋白基序、氨基酸序列比对、蛋白结构域及转录水平进行了分析，并对可能参与的功能进行了探讨，为进一步研究SPL基因在番茄、拟南芥、甘薯中的功能提供了一定借鉴作用。

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