朱丽珍 王芳 王娅丽 何军 李彦龙 田英

摘要：随着高通量测序技术的兴起，功能基因组学研究得以迅猛发展。基因组定点修饰技术作为一项研究特定基因功能的工具，对功能基因组学的研究具有极强的推动作用。CRISPR/Cas系统是一种适应性免疫防御系统，在细菌、古细菌的长期演化过程中形成，用于对抗入侵的病毒及外源DNA。通过对各种基因编辑技术的对比，发现相比于DNA同源重组、锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等技术，基于RNA指导的CRISPR/Cas系统为基因组定点编辑开辟了一条新的道路，在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等显著优点。从作用机制和发展历程等方面对目前基因编辑的4种技术进行简述，进一步总结CRISPR/Cas系统在经济林木、作物、植物病毒和牧草植物功能基因组编辑中的研究应用，以期为促进基因编辑技术在农牧生产中的应用提供参考。

关键词：基因编辑;CRISPR/Cas系统;草地植物开发;生产应用;功能基因组

中图分类号：S188; Q78  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）20-0022-08

收稿日期：2021-02-01

基金项目：宁夏自然科学基金（编号：2018AAC03223）;宁夏高等学校科学研究项目（编号：NGY2018008）;宁夏农林科学院农业高质量发展和生态保护科技创新示范课题（编号：NGSB-2021-2-01）。

作者简介：朱丽珍（1990—），女，山东菏泽人，博士研究生，助理研究员，主要从事植物资源开发利用研究。E-mail：lizhenzhu916@163.com。

通信作者：田 英，博士，副研究员，主要从事逆境植物资源开发利用研究。E-mail：tianying_1982@126.com。

结构基因组学和功能基因组学是基因组学的两大主要研究内容，其中结构基因组学研究旨在揭示基因的结构、序列信息及基因的定位和编辑机制等;功能基因组的研究旨在揭示基因的功能和进化原理。近年来，动植物物种全基因组测序飞速发展，测序结果陆续公布，大大推动了各组学的研究进展，功能基因组研究成为了研究的主流。基因组定点修饰技术是在基因组的精确位点上进行靶向修饰改造的技术，是目前研究基因功能的有利工具，对改造和验证特定基因的功能具有重要意义。

基因组编辑（genome editing，GE）作为基因组定点修饰技术，是当前生命科学研究的前沿领域[1]。目前，基因组编辑方法主要包括DNA同源重组技术、锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）技术、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技术以及CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins） 技术等，其中CRISPR/Cas9系统最便捷、高效，应用也最广泛[2]。目前，CRISPR/Cas9技术已应用于人类遗传病治疗[3]、细胞个性化治疗[4]、新药开发[5]及作物遗传改良[6]等领域。这些基因编辑技术的使用，使得生物体基因组DNA的靶向修饰成为可能。

1 基因编辑技术

1.1 DNA同源重組技术

DNA双链之间可发生核酸信息的交换和重组，根据这一原理可以进行基因组的靶向修饰，亦称为同源重组。该技术的具体操作方法是通过将人为改造后获得的重组DNA通过同源重组技术转入受体细胞核内，经过同源重组作用，受体细胞内原始的基因序列被重组的DNA序列替换，最终达到敲除受体细胞内靶基因序列的目的。

DNA同源重组技术是基因编辑初期的基因组靶向修饰技术，虽然该技术能导致目的基因失活，但是难以突破远缘杂交不亲和的障碍，不能产生新的基因，因此应用范围较为狭窄。Kim等研究发现，在高等植物和动物细胞中，外源DNA导入受体细胞后与靶标DNA序列同源重组的概率十分低，仅为0.9%左右，过低的靶向修饰效率大大影响了DNA同源重组技术的发展[7]。

1.2 ZFNs技术

ZFNs技术，即锌指核酸酶技术，是通过人工合成核酸内切酶，进而对目的基因进行定点修饰的技术[8]。ZFNs技术在DNA水平上进行靶基因的定向修饰，修饰效率可以达到10%及以上，并且可以稳定遗传给后代[9]。随着锌指核酸酶技术的开发，ZFNs技术被广泛应用于多种动植物中，Sander等利用CoDA（使用标准克隆技术或自定义DNA合成来设计ZFNs）ZFNs技术，快速改变了斑马鱼、拟南芥和大豆的20个基因[10]，CoDA的简单和有效使用，促使ZFNs技术的广泛应用成为可能，并为该技术运用到多基因通路或全基因组改变等方向成为可能。此外，ZFNs技术还被应用到人体培养细胞上，并从基因上改变了CD4+T细胞对HIV-1的抗性[11]。此外，该技术还被应用到小鼠、果蝇[12]及黑麦草[13]、水稻[14]等的研究中。

然而，ZFNs技术在基因操作的过程中，由于随机插入外源基因，容易出现突变和不易调控等，并且脱靶效应较为严重，因此缺乏DNA靶定特异性[15]，而这种DNA的靶定非特异性，易引发细胞毒性效应[16]，对受体细胞的活性产生不利影响。

1.3 TALENs技术

TALENs技术是一种新型的基因定点修饰技术，是基于TALE核酸酶的一种崭新的分子生物学工具[17]，被称为2012年度十大科学突破之一。Cermak等对TALENs技术进行研究发现，它主要由TALE蛋白和FokⅠ核酸内切酶2个元件组成，并且2个元件分工不同，随后将TALE蛋白与Fok Ⅰ核酸内切酶融合，发现TALE蛋白在此过程中负责特异性结合DNA序列，FokⅠ核酸内切酶负责在受体细胞内发挥剪切作用[18]。TALE特异性结合DNA的模式是一种特殊编码模式，可根据需求对任意靶基因的DNA序列进行人工设计，进而合成相应的TALE蛋白，无基因序列、细胞、物种的限制[18-19]。

自TALE序列被完全破译后，TALENs技术开始得到普及。TALENs的特异性切割活性在酵母[20]、拟南芥[21-22]、水稻[23]及斑马鱼[10]等多个动植物体系和体外培养细胞中得以验证。2014年魏文盛所在课题组依托一种自主研发的TALE蛋白组装技术完成了全部TALE元件的解码工作[24]。自2011年TALENs技术被首次成功运用于基因定点修饰[25]以来，发展十分迅速并在全球范围内广泛应用[26]。

与ZFNs相比，TALENs结合DNA的方式更便于预测和设计靶向基因序列，TALE蛋白的组装和构建有助于实现大规模和高通量的组装;此外，TALENs的特异性比ZFNs高，且毒性和脱靶性相对较低[27]。因此可以看出，TALENs技术是基因定点修饰发展史上又一新的里程碑，它特异性高、定点突变、稳定遗传等技术特点，促使它被广泛应用于各种动植物的基因定点修饰中。但是，在TALENs技术的应用中也暴露了很多缺点，例如导致细胞毒性、模块组装过于繁琐、测序工作量大，并且一般只能由大型的测序公司完成，成本和代价较高等，大大限制了TALENs技术的完善和发展[28]。

1.4 CRISPR/Cas技术

CRISPR指广泛存在于细菌和古细菌基因组中的成簇且具有规律间隔的短回文重复序列，与防御机制相关;Cas能够以一种序列依赖性的方式对DNA进行靶向切割作用，是一种与CRISPR系统关联的蛋白质和基因家族的简称[29]。CRISPR/Cas原理见图1。CRISPR/Cas9是一种新型基因编辑系统，但其作用与基因定点修饰的机制与RNA干扰（RNAi）过程相似，利用小CRISPR RNA（crRNA）分子与目标基因的特定DNA区段发生结合，再由相关内切酶Cas蛋白进行特异性切割，可以引发基因组的定点突变[30-31]。

CRISPR/Cas9系统有助于细菌对抗病毒、对付攻击者，从而保护自身[32]。研究者发现，CRISPR/Cas9作为一种万能基因编辑器，可用来激活、抑制、删除或者添加异体生物的目标基因[33]。早在1987年，日本的研究人员在调查细菌的一种编码碱性磷酸酶的基因序列时便发现了1段短重復的核苷酸序列，位于邻近DNA片段中间，且两侧为短特异片段，但是关于这些重复序列的生物学意义并不清楚[34]。2000年，短重复的核苷酸序列被命名为短间隔重复序列[35];2002年SRSR被重命名为CRISPR[36]。2013年2月，《Science》杂志上发表的2篇文章表明，CRISPR/Cas9系统能有效地靶向酶切293T、K562等多种细胞，且非同源末端连接同源重组效率为3%～25%，可用于动植物及人等基因组的编辑，从而开启了植物新型基因编辑的新纪元[37-38]。目前，在植物中，CRISPR/Cas9已对超过30种植物物种和数百个基因实现成功编辑，并且在农作物抗逆性及抗病虫害研究中的应用广泛[39-40]，在主要粮食作物中，改变并创造出了众多有益性状，可见CRISPR/Cas9技术作为一种可以在植物上广泛使用的生物技术而被迅速推广[41]。

2 CRISPR/Cas技术的优越性

根据基因编辑现有研究结果[7，26，42]，分别对ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas技术在靶点结合域、载体设计及构建难易程度、靶位点要求、细胞毒性、脱靶率、载体构建所需要时间和成本进行对比，详见表1。

通过对4种基因定点修饰技术的理解以及3种基因编辑的综合分析发现，DNA同源重组技术存在特异性低、修饰效率低、不可稳定遗传等较为突出的技术弊端。相比之下，ZFNs技术、TALENs技术以及CRISPR/Cas技术的发展前景则更为乐观[43]。但在基因组定点修饰方面，TALENs和ZFNs技术在实际操作过程中的技术难度较大、构建载体时间较长，不能在常规实验室得到高效利用，而CRISPR/Cas技术相对操作简单，制作成本低，可以在普通的分子生物学实验室进行广泛应用[44]。CRISPR/Cas技术能同时作用于多个靶位点[6]，并能精准完成对紧随其后的NGG （PAM序列） 20 bp序列的编辑[45]。此外，载体构建方面，ZFNs和TALENs技术对各基因位点进行编辑时都须设计和组装2个核酸酶，操作复杂且成功率低，而CRISPR/Cas系统中由于Cas9基因相同，只需对特定基因位点设计sRNA即可。因此可见，CRISPR/Cas系统更容易得到推广和应用[43]。

3 CRISPR/Cas技术在草地植物领域中的应用

CRISPR/Cas基因组编辑系统由Cas核酸酶蛋白和向导RNA 2个部分组成，其中向导RNA能够与基因组目标位点DNA序列互补配对，并引导Cas核酸酶蛋白对该互补序列进行定向剪切。作为一种简单有效的基因组编辑工具，CRISPR已在多种重要作物中实现了基因定点敲除、等位基因单碱基替换和外源DNA片段定点整合。目前该技术已被成功应用到拟南芥[46]、水稻[47]、小麦[48]、烟草[49]、番茄[50]、大豆[51]、地钱[52]、甜橙[53]、苜蓿[54]等基因组中单个位点及少数多个位点的修饰中。说明CRISPR/Cas9 基因组编辑技术能摆脱无干细胞系的限制，可在任何植物中实现定向、精准的基因修饰。

由于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1（Cas12a）等核酸酶可以针对特定基因组DNA序列实现可编程定向剪切[55]，并能以前所未有的精准度和便捷度进行基因组编辑，因此被广泛应用于动、植物及微生物的基因功能解析、新种质创制、基因治疗等基础研究及应用实践工作中，被认为是21世纪生物技术领域的重大突破[56]。CRISPR/Cas系统作为一种全新的基因编辑技术，除了在动物育种和疾病治疗中发挥了优势外，在植物基因功能的研究中也体现出其简便、高效的特点。CRISPR/Cas系统被发现以后，很快就被应用到了高等植物基因功能的研究中。此外，该技术还被成功用于对多种植物内源基因的编辑[57]，CRISPR/Cas9技术迅速成为植物研究的一种热门手段。

3.1 CRISPR/Cas9系统在木本植物功能基因组中的应用

目前，CRISPR/Cas9系统在木本植物中实现了基因组的编辑和靶位点的突变。佛罗里达大学柑橘研究团队首次采用CRISPR/LbCas12a（LbCpf1）对柑橘属中的西柚基因组进行了编辑，获得了可以定向修饰目的基因的转基因西柚，在有效缓解病原菌感染的同时，没有观察到潜在的脱靶效应[58]。此外，研究者在合成sgRNA靶向基因后，通过农杆菌的介导，向甜橙中导入Cas9及该靶向基因，最终获得目标位点靶向基因的突变。此外，有效利用RNA/sgRNA系统及启动子系统等已经在木本植物中实现了基因组序列的精准编辑和突变体基因的有效敲除。Liu等通过将CRISPR/cas9和农杆菌转化技术相结合，设计引导RNA靶定基因的不同基因组位点，建立了高效的杨树多基因靶向诱变技术，最终在转基因杨树中获得了明显的白化突变表型[59]。

3.2 CRISPR/Cas系统在作物遗传改良中的应用

作物改良對于产量、品质和抗性的提高至关重要，而遗传多样性是其改良的关键。CRISPR/Cas作为快速高效的遗传操作工具，在作物遗传改良方面亦表现出巨大的应用潜力。近年来，基因编辑在棉花上的应用也成为了研究的热点，其中华中农业大学金双侠教授团队2019年在《Plant Biotechnology Journal》上发表的2篇棉花基因编辑的文章就是其中的典型代表，该研究利用CRISPR/Cas9技术构建了适用于棉花遗传转化的碱基编辑系统，在全基因组水平预测了1 500个潜在脱靶位点后未发现脱靶效应，进一步证实单碱基编辑系统对棉花基因组编辑具有较强的特异性[60]。金双侠教授团队的另一研究以棉花内源叶绿体形成相关基因（GhCLA）为靶标，通过tRNA-sgRNA转录单元构建了基因编辑载体，对转化获得的目标位点进行检测，发现其突变率达到87%;进一步对最具潜力的6个脱靶位点进行检测后，并未发现脱靶效应，这为四倍体棉花建立高效的CRISPR/Cpf1基因编辑系统提供了良好的选择[61]。韩国的一个研究课题组利用双生病毒多复制子的特点优化了Cpf1介导的CRISPR系统，创建了依赖于CRISPR/Cpf1系统的同源重组插入外源DNA片段的载体表达系统，通过同源重组策略高效地在番茄中实现了基因编辑过程，为作物改良提供了更好的研究手段[62]。

福建农林大学关跃峰团队在前期高通量创制大豆多基因突变技术体系的基础上[63]，利用CRISPR/Cas技术成功地筛选出脂氧合酶 （LOX）失活株系，从根源上解决了大豆的豆腥味问题，该技术的应用可快速在主推大豆品种中叠加无豆腥性状，提升加工和营养品质，在一定程度上避免了基因聚合及亲本对品种选育时间的限制[51]，因此不影响其他主要农艺性状。在农艺性状改良过程中，一种不需要转基因的基因组编辑技术目前也得到了成功应用，该研究以小麦愈伤组织细胞为研究对象，瞬时表达CRISPR/Cas9的DNA或RNA，可获得纯合的小麦突变体再生植株，并且无任何转基因成分[64]，该技术的应用大大推进了小麦品质改良或者其他转化困难植物的研究进程。

3.3 CRISPR/Cas9技术在草地植物抗病毒中的研究应用

近年来，以CRISPR/Cas9系统为首的基因组编辑技术在植物与病毒互作的基因组研究中也得到了进一步的开发与完善。现有研究发现，CRISPR/Cas9系统能够抑制植物DNA病毒的扩展和蔓延[65]。Liu等通过在花椰菜中表达Cas9/sgRNA，发现Cas9能够删减或者突变花椰菜花叶病毒（CaMV） 基因关键功能区的核苷酸序列，进而抑制CaMV感染[66];而小干扰RNA（siRNAs）抑制CaMV感染的原因并未得到证实，说明CRISPR/Cas9技术对 CaMV具有强大的抗病毒特性。另一项研究表明，CRISPR/Cas9技术对菜豆黄矮病毒（单链DNA病毒）的抑制作用同样有效[67]，进一步证实CRISPR/Cas9系统对植物DNA病毒的抑制作用具有普遍适用性。

3.4 CRISPR/Cas技术在草类植物中的研究应用

CRISPR/Cas9技术在草类植物功能基因组学中的研究与柑橘、甜橙等经济林木和水稻、小麦等主要粮食作物相比严重滞后且处于起步阶段，而高通量测序技术的飞速发展大大推动了牧草植物基因组学研究。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是草类禾本科植物功能基因组学研究的模式植物，CRISPR/Cas9技术在其基因编辑方面已经获得成功应用。例如，李奇等通过对Bd ID1 （B. distachyon ID转录因子）基因不同外显子分别设计敲除位点，运用CRISPR/Cas9技术敲除目的基因Bd ID1，对获得的转基因后代进行基因型鉴定，获得导致Bd ID1功能完全缺失的株系，进一步验证ID1是禾本科特有的基因，与调控开花时间通路相关[68-69]。此外，刘瑶瑶利用CRISPR/Cas9技术分别敲除了二穗短柄草的BdVRN1和BdFUL2基因，完成了2个转录因子亚家族基因的编辑，并成功获得单碱基插入/缺失的突变体植株，为基因功能的进一步研究提供了基础材料[70]。CRISPR/Cas9技术在二穗短柄草基因功能研究中的应用，将为其他禾本科植物的遗传改良和育种提供参考和理论基础[71]。

目前，CRISPR/Cas9技术在草类植物中的研究逐步展开，其中包括1种重要的牧草资源——蒙古冰草，它不仅是一种重要的资源植物，还具有极高的饲用价值、遗传价值和生态价值[72]。此外，蒙古冰草蕴含大量抗性基因，对禾本科牧草或作物的抗逆性研究有重大潜力[73]。但是，相对于经济林木和作物研究，蒙古冰草功能基因的挖掘工作开展得较晚，尤其是基因编辑及CRISPR/Cas9技术在牧草方面的应用发展得较为缓慢。关于此方面的研究，目前仅有张文静等利用CRISPR/Cas9系统对蒙古冰草原生质体基因组进行编辑，建立了高效的蒙古冰草CRISPR/Cas9靶位点筛选系统，从而最终在原生质体基础上首次建立了高效蒙古冰草瞬时转化体系的报导[74]。对蒙古冰草功能基因的挖掘及分子育种带来革命性的影响，为后续快速构建蒙古冰草稳定的转化植株奠定了基础。

燕麦作为生长在温带冷凉地区主要的粮饲兼用作物，不但茎叶多汁、适口性好[75]，而且蛋白质、脂肪、可消化纤维的含量都比较高，是理想的粮食和饲料作物[76]。但是燕麦育种发展缓慢，尤其以基因编辑为主要手段的分子育种较少，与其他作物相比明显滞后。武志娟首次在燕麦育种中利用 CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，构建抗拿捕净除草剂表达载体后，利用基因枪法建立了高效的燕麦 CRISPR/Cas9基因编辑的最佳靶标位点筛选体系，最终获得2株Cas9编辑所产生的突变植株[77]，从而为基因编辑技术在草类植物分子育种中的应用提供了试验依据。

此外，紫花苜蓿作为世界上最重要的草地作物，被称为“牧草之王”。近年来，激增的家畜养殖对优质牧草，特别是紫花苜蓿的需求量极大增加，而国内尚缺乏自主知识产权的优质紫花苜蓿品种资源，优质苜蓿种子大量依靠进口。而且，由于紫花苜蓿具有同源四倍体和异花授粉特性，一直以来极大阻碍了其基因密码的破译和新品种培育。CRISPR/Cas9系统在紫花苜蓿中亦得到了有效应用。例如，Gao等应用Ⅱ型CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿SPL9基因进行编辑，并采用微滴式数字PCR（ddPCR）进行亚克隆和测序，最终成功应用CRISPR/Cas9技术对紫花苜蓿的四倍体基因组进行编辑，为紫花苜蓿育种提供了技术支持[78]，但在如何提高基因编辑效率方面还需要进一步探索。近日，研究者首次完成了同源四倍体紫花苜蓿基因组的破译并建立了基于CRISPR/Cas9技术的高效基因编辑育种体系，成功获得一批多叶性状稳定且不含转基因标记的紫花苜蓿新材料[79]。此外，研究者利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对控制花期调控基因进行定点敲除并结合杂交手段，成功创制出适宜低纬度地区种植的大豆材料，为豆科植物品种改良提供了新的基础材料[80]。

通过分析草地植物的研究现状，发现CRISPR/Cas9系统作为新型的植物基因编辑技术，关于其功能基因组的研究仍存在很大的研究空间及研究价值，尤其是近年来CRISPR/Cas9技术对牧草品种的改良具有巨大潜力和广泛的应用前景。

4 CRISPR/Cas技术在牧草植物中的应用前景及展望

牧草植物作为生态系统的重要组成部分，由于人类长期过度放牧和开垦等不合理利用造成草地退化、植被密度减小、盖度下降等，致使草地生态系统服务功能减弱、功能价值减少。随着高通量测序技术的迅速发展，越来越多植物的全基因组序列被公布出来，但是针对牧草植物的测序工作少之又少，并且关于基因功能研究、遗传改良、分子育种等研究的技术手段有限，种种因素都极大地限制了牧草植物分子育种的发展及功能基因组学的研究。然而，近年来已有大量研究者提出了各种有效的草地生态恢复手段，其中以CRISPR/Cas9技术为首的基因编辑技术在草地植被恢复过程中的应用是一个不容小觑的因素，该技术的应用能够因地制宜地挖掘乡土品种与抗逆性、高产、优质等相关的基因，并能在极大缩短育种年限的情况下，实现对优良草地植物的收集、开发、利用及草地生态功能的修复。

4.1 缩短牧草育种年限、精准育种，提高牧草产量

基因组编辑技术可以通过定向修饰植物基因组，进而推动植物育种进程，在实现牧草植物精准育种方面具有极大的开发潜力。然而，牧草许多重要农艺性状是由单个或少数核苷酸的改变或突变引起的，具有很多不确定性。牧草植物基因编辑困难重重，主要表现在同源重组在牧草植物中的效率极低，通过基因编辑的方式获得高效、稳定的基因组的精准性较差;获得理想的转基因植株费时且费力，传统的转基因技术只能将外源基因随机整合到植物基因组中，插入位点的随机可导致内源基因破坏和外源基因沉默等不利结果。与自然进化和传统转基因手段相比，基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑可利用外源修复模板通过同源重组介导的修复方式实现目标基因核苷酸的改变，因此，通过对控制牧草关键性状基因的编辑，可加快良种选育的进度。此外，在牧草功能基因研究领域，CRISPR/Cas技术的应用对实现定向育种，培育高产、抗逆等适应性强、生态价值高价的牧草植物具有重大潜力。例如，Chen等开发的基于CRISPR/Cas9的高效基因编辑技术体系，不仅成功培育了一批多叶型紫花苜蓿新材料，而且重要的是该编辑技术的应用无需导入外源基因和转基因过程，仅需获得自身的突变体即可，该技术的应用将大大加快传统育种的速度[79]。

4.2 挖掘牧草营养品质的代谢通路，改良牧草品质

目前，对牧草研究关注的重点大多是种植管理、适口性及营养品质分析等方面，对相关基因的研究，尤其是一些营养品质代谢通路上基因细节方面，如启动子、增强子、抑制子的研究并不深入;此外，绝大多数牧草的遗传转化体系还不完善，由于难以建立起有效的遗传转化体系而无法开展转基因研究。一系列生物技术应用的局限性限制了CRISPR/Cas系统在牧草植物功能基因研究中的应用。

吴香莹等研究了CRISPR/dCas9 系統对苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）320内源hemE基因的作用，可有效促进代谢流向维生素B12合成方向转移，不但丰富了可用于分析苜蓿中华根瘤菌的工具库，也为苜蓿遗传和营养品质代谢研究提供了新思路[81]。此外，苜蓿中木质素含量高是饲料消化率低的限制因素之一。传统方法可通过尝试减少木质素的含量来提高苜蓿饲料的消化率，但效果均不显著。而CRISPR/Cas9技术则可以在短时间内实现这一目标。Meng等优化并开发一种农杆菌介导的CRISPR/Cas9系统，成功诱导紫花苜蓿靶向基因组的修饰，并利用该系统，获得了T0代内源基因MtPDS的单等位基因和双等位基因纯合子突变体，进一步证明CRISPR/Cas9系统可以作为研究基因功能的有效工具[54]，为CRISPR/Cas9技术在减少木质素的含量、提高苜蓿饲料的消化率方向的应用提供了参考价值。此外，Cai等利用改造后的CRISPR基因组编辑系统，率先实现了豆科植物基因的单碱基替换，并获得了表型稳定的纯合突变系[82]，为豆科植物重要农艺性状的定向改良提供了新技术、新路径。

4.3 提高牧草植物对除草剂的抗性

牧草植物在大面积推广种植过程中杂草危害严重，而人工除草成本很高，利用除草剂对不同植物类型进行选择性防除，并开发出专用型除草剂在很多大田作物上得到了实现。研究发现，乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）基因是禾本科植物抗拿捕净除草剂的关键基因，除草剂的抗性变化与异亮氨酸能否突变为亮氨酸相关。因此，研究者可以通过构建乙酰辅酶A羧化酶基因的CRISPR/Cas9表达载体，通过编辑禾本科牧草的ACCase基因，找到氨基酸突变关键位点序列，进而促使禾本科牧草对除草剂产生抗性。该方法已经在燕麦上得到了实现，研究者通过CRISPR/Cas9基因编辑技术完成了对燕麦转基因植株中ACCase基因的成功敲除，尽管没有完成靶向敲除，但也为后续通过禾本科牧草基因组编辑产生抗除草剂特性试验提供理论依据[83]。

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