石倩倩，敖青青，韦兰成，郭松超,，唐 深，李习艺，欧阳轶强，陆彩玲△

（广西医科大学 1.公共卫生学院；2.基础医学院；3.实验动物中心，南宁 530021）

乳腺癌是一类常见严重危害女性健康的高度异质性肿瘤，是女性癌症死亡的主要原因。据统计，我国乳腺癌发病率逐年上升，现已居女性恶性肿瘤发病的首位，且发病越来越年轻化[1-2]。乳腺癌的发生发展受诸多因素影响。建立适宜的乳腺癌动物模型，有助于整体研究乳腺癌的发生发展，对乳腺癌的防治具有重要意义。树鼩是一种新兴的实验动物，其全基因组测序结果与灵长类动物具有高度同源性，在诸多方面（如：生理代谢、免疫、遗传等）与人类具有较高的相似性[3]。近年来，树鼩广泛的应用于乳腺癌动物模型，并取得一定的进展[4-5]。代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化相对关系的研究方法。大量的研究显示，在乳腺癌的发生发展过程中，机体的代谢也随着发生变化，这些代谢物质可以成为新潜在的筛查和诊断乳腺癌的方法标志物[6-7]。但近年来，在乳腺癌的研究中，以树鼩为动物模型且运用代谢组学技术分析的研究却鲜有报道。因而，在本研究中，我们通过构建树鼩乳腺癌模型，采用GC-TOFMS 技术，检测自发乳腺癌树鼩血清代谢物的变化，从代谢组学角度阐述其代谢产物的变化特征，为进一步探究乳腺癌发病的潜在生物标志物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年雌性树鼩（4 月龄及以上）50只，健康未育，体重（130±10）g，由中国科学院昆明动物研究所提供（实验动物生产许可证：SCXK（滇）K2016-0002）。饲养于广西医科大学普通级动物饲养室（实验动使用许可证：SYXK 桂2020-0004），喂饲树鼩专用的全价饲料，自由饮水。饲养室保持温度20～25 ℃，湿度30%～60%，每日清洁2次。实验动物的处理方法均经广西医科大学实验动物伦理委员会批准（批准文号:201804054）。

1.2 主要试剂 甲醇（CNW Technologies，德国），氯仿及吡啶（上海阿达玛斯有限公司），L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司），饱和脂肪酸甲酯（Dr.Ehrenstorfer，德国）。

1.3 样本采集与制备 观察记录各组树鼩的体重及体长等基础信息，实验观察期限为24个月。实验观察期限结束后，从自发发生乳腺癌的树鼩中选取7 例病理组织学鉴定确诊为乳腺癌的为模型组（T组），同时选取12 例为未发生乳腺癌的健康树鼩为对照组（C 组）。对树鼩进行采血1～1.5 mL 放入无抗凝剂离心管中，放置4 ℃冰箱2 h，4 ℃离心取上层血清分装于1.5 mL 离心管中，放置-80 ℃超低温冰箱保存待检。

1.4 血清代谢组学分析

1.4.1 样品前处理 血清样本解冻后，取样本50 μL于1.5 mL EP管中，加入200 μL预冷提取液甲醇，再加入5 μL L-2-氯苯丙氨酸，涡旋30 s 后超声10 min（冰水浴）；将其放入4 ℃离心机离心（12 000 rpm/15 min）；随后小心移取上清液于EP 管中并在真空浓缩器中干燥（每个样本各取30 μL混合成QC样本）；后加入30 μL甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20 mg/mL），轻轻混匀后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min；加入40 μL BSTFA（含有1% TMCS，v/v），将混合物70 ℃孵育1.5 h；冷却至室温，向混合的样本中加入5 μL FAMEs（溶于氯仿）；随机顺序上机检测。

1.4.2 仪器设置和进样分析 使用气相色谱仪—飞行时间质谱仪对样本进行检测分析。具体参数如下：系统色谱柱采用DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）自动进样，进样体积为1 μL。以氦气作为载气，前部入口吹扫流量为3 mL min-1，通过色谱柱的气体流速为1 mL min-1。初始温度保持在50 ℃下1 min，再以20 ℃min-1的速率升至310℃，最后在310℃下保持6 min。质谱接口、传输线和离子源温度分别为280 ℃、280 ℃和250 ℃。采用EI 源，碰撞电压设置为70 eV质谱，全扫描模式（M/Z 50-500），扫描速度为12.5 spectra/s。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示。代谢组学数据使用SIMCA软件（V15.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden）进行分析。检测所得的代谢物采用正交偏最小二乘法—判别分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA）；差异代谢物筛选卡值标准为t检验的P值＜0.05，同时OPLS-DA 模型第一主成分的变量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）＞1。使用京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、MetaboAnalyst分析出相应的代谢通路。

2 结果

2.1 树鼩的基本情况 到观察结束时，C组树鼩体重为（123.65±10.54）g，体长为（17.73±0.65）cm；T 组树鼩体重为（118.6±19.44）g，体长为（17.07±0.19）cm，肿瘤质量为（0.75±0.66）g。

2.2 各组树鼩总离子流图 通过GC-TOFMS分析研究两组间血清样品的代谢物图谱，从血清样本中提取了493 个峰，经过进一步的处理，最后确定了451 个特征峰。如图1 所示，可看出样品出峰均匀，强度适中，适宜T组与C组的血清样品分析。在色谱质谱联用仪检测中，QC 样本可用于评价其系统的稳定性，QC 样本相关性越接近于1（应≥0.7），表明模型稳定性越好数据质量越高，见图2。

图1 两组树鼩血清的总离子流图

图2 QC样本相关性分析图

2.3 OPLS-DA 分析 OPLS-DA 得分图（图3A）说明，两组血清样本区分非常显著，且几乎处于95%置信区间内。置换检验结果（图3B）说明构建的OPLS-DA模型符合真实情况，无拟合过度现象。

图3 OPLS-DA得分图和OPLS-DA模型的置换检验结果图

2.4 差异代谢物的筛选 通过SIMCA-V15.0.2 进行分析，以OPLS-DA 模型第一主成分的变量投影重要度（VIP）＞1 及P＜0.05，筛选出的结果见图4A。通过对筛选出的差异代谢物进行定性，共定性到32种差异代谢物，其中14种已知（表1）。与正常对照组相比，自发乳腺癌组中有13种下调，1种上调（图4B）。

表1 树鼩自发乳腺癌关键差异代谢产物

图4 差异代谢物筛选火山图和层次聚类分析结果热力图

2.5 差异代谢物的代谢通路分析 对筛选出的14种差异代谢物经MetaboAnalyst通路富集分析，确定正常对照组与自发乳腺癌组的差异代谢物相关的生物学途径（图5），通路影响值提示，精氨酸和脯氨酸代谢、花生四烯酸代谢通路与树鼩自发乳腺癌代谢调节的作用机制密切相关。对上述代谢物参与的代谢途径进行整合分析，通过KEGG数据库处理上述代谢的代谢过程，得到4 种标志性差异代谢产物通路，归属结果见表2。

图5 代谢通路气泡图

表2 4种差异代谢产物代谢通路归属

3 讨论

本研究对19 只纳入时体重及体长等无差别的树鼩进行了24个月的观察，至观察结束，7只树鼩先后自发了乳腺癌。进一步地，采用GC-TOFMS比较了正常树鼩与自发乳腺癌树鼩中血清代谢物的差异，通过生物信息学技术分析差异代谢物，确定血清中脯氨酸、羟脯氨酸、肌酸以及花生四烯酸存在差异，极有可能参与树鼩乳腺癌的自发过程。

脯氨酸为环状α-亚氨基酸，是合成人体蛋白质的重要氨基酸之一。其在蛋白合成、机体的新陈代谢、抗氧化及免疫反应等方面发挥着重要的调控作用。羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）是一种非必需氨基酸，主要存在于胶原组织中，是构成胶原的重要成分之一，可由脯氨酸转变而成。羟脯氨酸作为胶原蛋白中的特异性氨基酸，可以反映机体中胶原蛋白含量的变化，而胶原蛋白含量变化又与许多疾病有关（如烧伤、肝硬化、肿瘤等）。肿瘤细胞快速增殖往往需要大量的氨基酸，并以此维持旺盛的蛋白合成和能量供给[8]。本研究乳腺癌组血清中的脯氨酸及羟脯氨酸水平低于正常组，可能是乳腺癌细胞代谢旺盛，摄取并消耗机体脯氨酸及羟脯氨酸致血清中的丰度降低。与人类乳腺癌研究中也有脯氨酸及羟脯氨酸下降的报道一致[9]。

肌酸是一种含氮的有机酸，可快速为细胞提供能量。随着肿瘤的生长，肿瘤体积增加，癌细胞快速无限增殖，所需的能量也随着增加，需要大量的三磷酸腺苷（ATP）参与。但在机体内ATP的存储量较少，且合成速度较慢。本实验乳腺癌组组中肌酸含量出现显著下调，可能是癌细胞的增殖需要消耗大量的肌酸以合成ATP。在人乳腺癌患者血浆代谢组学中，肌酸在癌症患者血浆中也表现为降低[8]。同时，在患乳腺癌猫血清的代谢组学研究中，也有肌酸降低的报道[10]。

花生四烯酸（arachidonic acid，AA）是n-6 系列多不饱和脂肪酸中重要的脂肪酸，对哺乳动物而言是必需的。花生四烯酸在生物体内主要是以磷脂的形式存在于细胞膜上，在磷脂酶A2和磷脂酶C的作用下分解释放为游离的AA，且转变为具有生物活性的代谢产物，并与肿瘤的发生发展密切相关[9]。本研究结果显示，相较于对照组，自发乳腺癌组中的花生四烯酸水平明显降低，与文献报道一致[11]。AA能刺激鞘磷脂转变为神经酰胺，诱导细胞凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的[12]。本研究中乳腺癌组的花生四烯酸含量低于正常组，可能有助于肿瘤细胞生长。

综上所述，脯氨酸、羟基脯氨酸、花生四烯酸和肌酸的改变与树鼩自发乳腺癌的发生与发展密切相关。这些差异代谢物表明，树鼩乳腺癌发生过程中，机体代谢变化涉及了花生四烯酸及精氨酸、脯氨酸代谢途径。差异代谢物在乳腺癌发生发展中的确切机制有待进一步探索。