朱明霞，何花丽，朱芳芸，刘 倩，姚建华

（1.西安市第四医院麻醉科，西安 710004；2.陕西中医药大学附属医院手术麻醉科，咸阳 712000）

口腔癌是最常见的口腔恶性肿瘤，超过90%的口腔癌是口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），其特征是分化和淋巴结转移[1]。尽管研究和治疗方面取得了进展，但在过去的几十年中，OSCC 的5 年生存率很低，并且OSCC 的发生率保持在50%左右[2]。实际上，OSCC的治疗包括外科手术，放疗和化疗。然而，由于肿瘤转移和复发，晚期OSCC 患者在外科治疗、化疗和放疗中效果较差[3]。围手术期护理和麻醉管理被认为是重要的因素,可能影响癌症复发、转移和患者生存[4]。阿片类药物是围手术期镇痛中最常用的镇痛剂类型。舒芬太尼作为一种强效的阿片类镇痛药，起效快，消除半衰期短，对血流动力学影响很小[5]。但舒芬太尼在肿瘤中的作用及其机制还不清楚。本文研究舒芬太尼对人OSCC细胞系CAL27生长、侵袭和干细胞样特性的影响以及线粒体凋亡通路的调节，以期为舒芬太尼在OSCC治疗中的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、DMEM 培养液、胰酶购自美国Invitrogen 公司；RIPA 裂解缓冲液、BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司；兔抗VEGF（ab32152，英国Abcam），兔抗Vimentin（ab92547，英国Abcam），兔抗SOX2（ab92494，英国Abcam），兔抗OCT4（ab200834，英国Abcam），兔抗Bax（ab32503，英国Abcam），兔抗Bcl-2（ab196495，英国Abcam），兔抗Caspase3（ab13847，英国Abcam）,兔抗c-Myc（ab32072，英国Abcam），兔抗GAPDH单抗（ab181602，英国Abcam）；HRP 标记的山羊抗兔IgG二抗（ab6728，英国Abcam）；细胞凋亡检测试剂盒和BrdU 试剂盒购自南京凯基生物有限公司；Transwell小室及MatrigelTM底膜基质购自美国BD公司；ALDEFLUOR 分析试剂盒购自加拿大Stem Cell Technology公司。CO2培养箱购自美国Thermo公司；高速低温离心机购自德国eppendorf 公司；电转仪、电泳槽购自美国Bio-Rad公司；FACScan流式细胞仪购自美国Beckman coulter 公司；GDS-800 UVP凝胶成像系统购自美国UVP公司。

1.2 细胞培养

人OSCC CAL27 细胞购自购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），在含有10%FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL 链霉素的DMEM 中于37 °C、含5%CO2湿润条件下培养。细胞汇合率达到85%以上时用0.25%胰酶进行消化传代。

1.3 CCK-8检测细胞存活率

将CAL27 细胞以1×103/孔的密度接种到96 孔板中，加入不同浓度（0 nmol/L，1 nmol/L，2.5 nmol/L，5 nmol/L，10 nmol/L，25 nmol/L，50 nmol/L，100 nmol/L，200 nmol/L，300 nmol/L，400 nmol/L）的舒芬太尼，0 nmol/L 舒芬太尼作为对照组，培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37°C孵育2 h，酶标仪读取波长450 nm下的吸光度值，绘制折线图并计算细胞存活率（细胞存活率=实验组细胞吸光度/对照组细胞吸光度）。

1.4 BrdU检测细胞增殖

将CAL27 细胞随机分为4 组，分为舒芬太尼0 nmol/L组、10 nmol/L组、25 nmol/L组和50 nmol/L组，分别以1.0×104/孔的密度接种到24孔板（含盖玻片）中，用舒芬太尼0 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L处理48 h后。加入BrdU孵育2 h，固定盖玻片上的细胞，然后用抗BrdU抗体处理过夜。PBS洗涤，然后加入底物，15 min 后测量吸光度值（370～492 nm）。

1.5 Transwell检测细胞侵袭

收集按“1.4项”分组处理过的细胞消化离心，加入无血清DMEM制备含有5×105cells/mL的细胞悬液。将500µL含10%FBS的DMEM添加到上腔室中。在37°C 和5%CO2中孵育24 h 后，轻轻去除未侵袭的细胞和细胞外基质凝胶。将侵入膜的细胞染色20 min，用PBS 洗涤，然后在空气中干燥。随机选择5个视野，用显微镜对入侵的细胞进行计数。

1.6 显微观察肿瘤成球情况

收集按“1.4 项”分组处理过的对数生长期的CAL27 细胞，用DMEM 培养基洗1 次并重悬，血细胞计数器统计细胞密度。在低黏孵6 孔板中加2%B27,20 ng/mL bFGF 和20 ng/mL EGF 的DMEM/F12培养基，每孔接种1 000个细胞，置于5%CO2恒温培养箱中。每隔2 d 补加新鲜培养基，分别加药处理14 d，于倒置显微镜下拍照观察。

1.7 流式分选ALDH阳性细胞

将CAL27细胞以每孔1×106个细胞的密度接种到6孔板中，收集按“1.4项”分组处理过的CAL27细胞，重悬于1 mL ALDEFLUOR 缓冲液中，加入5 μL氟硼荧—氨基乙醛（BAAA）并短暂混合后，立即将300 μL 细胞悬液转移至装有5 μL 二乙基氨基偶氮苯（DEAB）的离心管中，用移液器均匀混合。然后将两个离心管放入细胞培养箱中，以使反应在37°C下进行40 min。将细胞用2 mL ALDEFLUOR 缓冲液洗涤两次，并最终重悬于500 μL 补充有DAPI 的ALDEFLUOR缓冲液中以染色死细胞，在流式仪上完成样品分析。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡

取按“1.4 项”分组处理过的CAL27 细胞，将细胞以3 000 r/min 的速度离心5 min，然后弃去上清液，并将沉淀以1.0×106细胞/mL 的密度重悬于1×结合液中。各取100 μL的样品溶液与5 μL FITC偶联的Annexin V和5 μL PI在室温下避光孵育15 min，向每个样品管中加入400 μL 1×结合液，使用FACScan 流式细胞仪进行流式分析，使用FlowJo 软件进行数据分析。

1.9 免疫印迹法

取按“1.4 项”分组处理过的细胞，使用RIPA 裂解缓冲液裂解细胞样品，BCA测定蛋白质浓度并调平。取30 mg 蛋白质的样品在10% SDS-PAGE 中电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用含有5%脱脂牛奶的TBST 缓冲液封闭2 h，随后加入一抗（VEGF,1∶1 000;Vimentin,1∶1 000;SOX2,1∶1 000;OCT4,1∶1 000,Bax,1∶1 000,Bcl-2,1∶1 000,Caspase3,1∶1 000,c-Myc1∶1 000）于4 ℃孵育过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，洗膜后ECL曝光成像并用quantity one软件分析蛋白条带的灰度值。

1.10 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的舒芬太尼对CAL27 细胞活力的影响

如图1 所示，舒芬太尼浓度不低于25 nmol/L时，CAL27细胞的存活率较舒芬太尼浓度为0 nmol/L时显著降低（P＜0.05），并呈浓度依赖的方式。选择舒芬太尼0 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L和50 nmol/L进行后续实验探究。

图1 CCK8检测CAL27细胞活力

2.2 不同浓度的舒芬太尼对CAL27 细胞生长的影响

如图2a所示，舒芬太尼0 nmol/L组可见大量绿色标记的阳性细胞。舒芬太尼25 nmol/L 组和舒芬太尼50 nmol/L 组绿色标记的阳性细胞较对照组减少。如图2b 所示，与舒芬太尼0 nmol/L 组比较，舒芬太尼25 nmol/L组和舒芬太尼50 nmol/L组阳性细胞数显著减少（P＜0.05）。

图2 不同浓度舒芬太尼对CAL27细胞增殖的作用

2.3 不同浓度的舒芬太尼对CAL27 细胞侵袭力的影响

如图3a 所示，与舒芬太尼0 nmol/L 组比较，可观察到舒芬太尼25 nmol/L组和舒芬太尼50 nmol/L组侵入到小室膜底侧的CAL27 细胞数量明显减少。如图3b 所示，与舒芬太尼0 nmol/L 组比较，舒芬太尼25 nmol/L组和舒芬太尼50 nmol/L组侵袭细胞数显著减少（均P＜0.05）。

图3 不同浓度舒芬太尼对CAL27细胞侵袭的作用

2.4 不同浓度的舒芬太尼对VEGF 和Vimentin 的蛋白表达影响

如图4所示，与舒芬太尼0 nmol/L组比较，舒芬太尼25 nmol/L组和舒芬太尼50 nmol/L组VEGF和Vimentin的蛋白表达水平均显著降低（均P＜0.05）。

图4 不同浓度舒芬太尼处理后VEGF和Vimentin蛋白表达变化

2.5 不同浓度的舒芬太尼对肿瘤干细胞成球的影响

如图5所示，与舒芬太尼0 nmol/L组比较，可观察到舒芬太尼25 nmol/L组和舒芬太尼50 nmol/L组肿瘤干细胞成球的体积变小，数量减少。

图5 不同浓度舒芬太尼处理后肿瘤干细胞成球的变化

2.6 不同浓度的舒芬太尼对肿瘤干细胞特性的影响

如图6a和b所示，与舒芬太尼0 nmol/L组比较，舒芬太尼10 nmol/L 组、舒芬太尼25 nmol/L 组和舒芬太尼50 nmol/L 组ALDH+的细胞数均显著降低（P＜0.05）。如图6c和图6d所示，与舒芬太尼0 nmol/L组比较，舒芬太尼25 nmol/L组和舒芬太尼50 nmol/L组SOX2和OCT4蛋白表达水平均显著降低（均P＜0.05）。

图6 不同浓度舒芬太尼处理后ALDH+细胞及SOX2、OCT4蛋白表达水平的变化

2.7 不同浓度的舒芬太尼对线粒体凋亡通路蛋白表达的影响

如图7所示，与舒芬太尼0 nmol/L组比较，舒芬太尼10 nmol/L 组、舒芬太尼25 nmol/L 组和舒芬太尼50 nmol/L组Bax/Bcl-2蛋白表达水平均显著升高（均P＜0.05）；舒芬太尼25 nmol/L 组和舒芬太尼50 nmol/L组Caspase-3 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；舒芬太尼25 nmol/L 组和舒芬太尼50 nmol/L组c-Myc蛋白表达水平均显著降低（均P＜0.05）。

图7 不同浓度舒芬太尼处理后Bax/Bcl-2、Caspase-3、c-Myc蛋白表达水平的变化

3 讨论

局部麻醉药的作用范围很广，其作用已超出其众所周知的麻醉和抗心律不齐的特性。最近的研究表明，局部麻醉药可抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，在癌症治疗中发挥作用[6]。体外研究证实，局部麻醉药对癌细胞具有细胞毒性作用[7]。舒芬太尼是一种阿片类药物，是临床上最常用的麻醉药物。本研究结果表明，舒芬太尼浓度不低于25 nmol/L时明显对CAL27 细胞具有显著毒性作用，且CAL27 细胞的存活率以舒芬太尼浓度依赖的方式降低。本研究选择舒芬太尼（0 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L）进行后续实验。

肿瘤细胞的增殖对肿瘤的发生发展具有重要作用[8]。研究表明，舒芬太尼在体外可抑制肝癌细胞的增殖生长[9]。与前人研究结果一致，本研究结果表明，舒芬太尼处理OSCC 细胞CAL27 后，BrdU阳性细胞数减少，表明舒芬太尼可抑制OSCC 细胞的生长。

恶性肿瘤细胞具有向周围正常组织浸润和侵袭的能力[10]。人OSCC 具有侵袭转移潜能，这是导致治疗失败的主要原因。已有研究表明，阿片类药物可通过下调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），显著降低癌细胞的黏附、侵袭和转移能力，而其中舒芬太尼治疗后能降低侵袭细胞数，从而抑制NCI-H460细胞的侵袭[11]。本研究结果显示，舒芬太尼处理OSCC 细胞CAL27 后，侵袭细胞数减少；VEGF 和Vimentin 的蛋白表达水平降低。因此，舒芬太尼可抑制OSCC细胞的侵袭能力。

OSCC 肿瘤干细胞能产生异质肿瘤细胞，具有很强的自我更新能力，促进肿瘤的发生发展，与OSCC 的复发和转移密切相关。ALDH 在实体恶性肿瘤如结肠、乳腺、肝脏、肺肿瘤及头颈部鳞状细胞癌中均有表达[12]。ALDH 的表达并与口腔癌分期、耐药及淋巴结转移相关[13]。在肿瘤干细胞中，SOX2在恶性鳞状细胞的存活中起着至关重要的作用，并且可以保护肿瘤干细胞免受凋亡的影响[14]。OCT4和SOX2的表达随着肿瘤分期和大小的减少以及淋巴结转移的减少而增加[15]。有研究表明，OCT4 参与了OSCC内的肿瘤转化、致瘤、侵袭和转移[16]。本研究结果显示，舒芬太尼处理OSCC 细胞CAL27后，肿瘤干细胞成球的体积变小，数量减少；ALDH阳性细胞数减少；SOX2,OCT4蛋白表达水平降低，提示舒芬太尼可能通过降低肿瘤干细胞特性影响OSCC的发生发展。

促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间动态平衡的维持对于细胞凋亡发挥重要作用。已有研究发现，舒芬太尼可通过上调Caspase-3 表达，促进大鼠肝癌瘤细胞的凋亡[17]。Bcl-2 和Bax 是两种重要的细胞凋亡蛋白，Bax/Bcl-2比值决定细胞在体内是否发生凋亡[18]。舒芬太尼通过上调Bax 蛋白表达和下调Bcl-2 蛋白表诱导A549 细胞的凋亡[19]。本研究结果显示，舒芬太尼处理OSCC细胞CAL27后，Bax/Bcl-2 的比值和Caspase-3 蛋白表达水平升高；c-Myc 蛋白表达水平显著降低，提示舒芬太尼可能通过上调Bax/Bcl-2 的比值和Caspase-3 蛋白表达水平，下调c-Myc蛋白表达，促进OSCC细胞凋亡。

综上所述，舒芬太尼可抑制人OSCC 细胞系CAL27 生长、侵袭和干细胞样特性，促进CAL27 细胞凋亡，在OSCC 中发挥抑癌作用，为舒芬太尼在OSCC的临床治疗中提供了实验依据。