张议文 刘辉 冯成天 胡义钰 王真辉 袁坤

摘  要：氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase，β-CAS）是植物氰化物解毒的关键酶，在调节植物生长发育及逆境胁迫中扮演重要角色。本研究从巴西橡胶树中克隆氰丙氨酸合成酶基因HbCAS，并对其进行分析。结果表明：HbCAS基因开放阅读框长为1113 bp，编码370个氨基酸，其理论分子量为40.15 kDa，等电点为8.90，属于色氨酸合成酶超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示，HbCAS基因在橡胶树各种组织中均有表达，其中在胶乳中的表达量最高。同健康树相比，HbCAS基因在死皮树中的表达显著下调。过氧化氢及乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸及脱落酸等多种激素均能调控HbCAS基因的表达。同时，HbCAS基因的表达也受干旱、低温、甲基紫精、高盐等多种非生物胁迫调节。本研究结果揭示HbCAS基因可能在橡胶树死皮发生、活性氧信号、激素调节及多种非生物胁迫应答中起重要作用。

关键词：巴西橡胶树;氰丙氨酸合成酶;死皮;胁迫应答

中图分类号：S794.1      文献标识码：A

Cloning and Expression Analysis of a β-cyanoalanine Synthase Gene HbCAS in Hevea brasiliensis

ZHANG Yiwen1， LIU Hui2， FENG Chengtian2， HU Yiyu2， WANG Zhenhui2， YUAN Kun2*

1. College of Tropical Crop， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： β-cyanoalanine synthase （β-CAS）， a key enzyme involved in cyanide detoxification in plants， plays an important role in regulating the growth and development and stress response. In this study， HbCAS was cloned from H. brasiliensis. The results indicated that HbCAS had an open reading frame （ORF） of 1113 bp， encoding 370 amino acids with a theoretical molecular weight 40.15 kDa and an isoelectric point of 8.90， belonging to the superfamily of tryptophan synthase beta. Quantitative real-time PCR analysis showed HbCAS was found to express in all tested tissues with the highest expression in latex. Compared with the healthy trees， HbCAS expression significantly decreased in the tapping panel dryness （TPD） infected trees. Hydrogen peroxide （H2O2） and various hormones of ethephon （ETH）， Methyl jasmonate （MeJA）， salicylic acid （SA） and abscisic acid （ABA） all regulated the expression of HbCAS. Meanwhile， HbCAS expression was regulated by diverse abiotic stresses of drought， low temperature， methyl viologen and high salt. These results suggest that HbCAS might play key roles in TPD onset， reactive oxygen species signaling， hormone regulating， as well as various abiotic stresses responses.

Keywords： Hevea brasiliensis; β-cyanoalanine synthase; tapping panel dryness; stress response

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.003

氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase，β-CAS）是植物降解氰化物的關键酶。生氰糖苷又称为氰苷，是植物的次生代谢产物，含有生氰糖苷的植物为生氰植物。当植物遭受外界胁迫时，生氰糖苷会与其降解酶接触发生酶促水解反应，释放出有毒物质氢氰酸（HCN）[1-3]。为了控制植物细胞内氰化物的浓度，植物利用β-CAS进行解毒。β-CAS以HCN和半胱氨酸为底物催化合成β-氰丙氨酸，氰丙氨酸进一步被转化为天冬酰胺[3]。

β-CAS广泛存在于植物中。在拟南芥中有3个编码β-CAS的基因，分别为CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2[4]，在烟草中有2个编码β-CAS的基因[5-6]。已有研究表明，β-CAS参与多种生物学过程，其活性受病原及环境胁迫等调节。拟南芥AtCysC1参与了对病原菌的应答[7]。干旱胁迫能显著提高烟草叶片和根中β-CAS活性，复水后其活性下降[5]，过表达β-CAS的烟草植株增加了对盐胁迫的耐性，而β-CAS基因沉默植株则更易遭受氧化胁迫损伤[6]。此外，β-CAS还参与了根毛形成、种子发芽等过程[8-9]。

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是天然橡胶的主要来源，具有重要的经济价值，但橡胶树死皮却严重降低了胶园产量。橡胶树是典型的生氰植物，细胞质基质中含有生氰糖苷[10]和β-CAS[11]。已有研究显示，正常树中β-CAS酶活性很高[11]，而死皮植株中β-CAS酶活性极低[12-14]。β-CAS可能在调节橡胶树死皮发生过程中扮演重要角色，但目前关于橡胶树β-CAS基因的功能研究还未见报道。本研究对橡胶树HbCAS基因进行了克隆，并对其编码的蛋白进行多序列比对及系统进化分析，同时，采用实时荧光定量PCR技术对HbCAS基因在不同组织及不同处理条件下的表达模式进行系统分析，从而为进一步阐明HbCAS基因在橡胶死皮发生中的功能奠定理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

本研究所用的实验材料为巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）品系‘热研7-33-97，该品系于1991年定植在中国热带农业科学院试验农场。采集‘热研7-33-97稳定叶、衰老叶、雌花、雄花、胶乳、树皮、新梢等组织样品，其中根部组织样品取自移栽培养6个月的‘热研7-33-97组培苗，于?80 ℃保存备用。各组织样品包含3个生物学重复，每个重复选取3棵树。

选取长势相同的‘热研7-33-97组培苗进行过氧化氢（H2O2）、乙烯利（ETH）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、甲基紫精（MV）、干旱处理（PEG）、低温处理（cold）及高盐胁迫（salt）处理。H2O2的处理参照Zhu等[15]的方法，处理浓度为20 mmol/L;ETH和MeJA的处理参照Hao等[16]的方法，处理浓度分别为10 mmol/L和200 μmol/L;ABA、SA和MV处理浓度分别为200 μmol/L、5 mmol/L和200 μmol/L。低温处理是将组培苗置于人工气候箱中，处理温度为4 ℃，光照强度600 μmol/（m2·s），光照时间为16 h;将组培苗的培养基质洗净，根部浸泡于20%聚乙二醇6000（PEG6000）中来模拟干旱环境;采用400 mmol/L NaCl处理来模拟高盐胁迫条件。以不做任何处理的组培苗为对照，分别在处理后3、6、12、24、48 h时采集叶片，用液氮冻存，用于RNA提取。

1.2  方法

1.2.1  总RNA提取、反转录及HbCAS基因克隆  胶乳提取方法参照天根（TIANGEN）公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，其他不同组织RNA的提取方法参照BioTeKe通用植物总RNA提取试剂盒说明书。参考反转录试剂盒（TaKaRa Prime Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser）说明书去除RNA里混杂的少量DNA，并按照步骤合成第一链cDNA。

根据拟南芥β-CAS基因序列搜索橡胶树基因组数据库，获得与其相似的序列scaffold0194_ 110039，采用Primer3（http：//primer3.ut.ee/）软件设计特异性引物，HbCAS-F：5?ACTGTGGAG TGTGGGAAGAG?3，HbCAS-R：5?ACCCCATC CCAAAGCACTTA?3。以橡胶树‘热研7-33-97胶乳cDNA为模板，用PCR扩增目标基因，扩增体系为：cDNA模板5 μL，5×TransStart? FastPfu Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.75 μL，TransStart? FastPfu DNA Polymerase （2.5 U/μL） 0.5 μL，加入ddH2O至總体积为25 μL。PCR程序如下：95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环。将PCR产物与1 μL pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector进行连接，加连接产物于50 μL Trans1-T1感受态细胞，鉴定为阳性的克隆送上海铂尚生物技术有限公司测序。

1.2.2  HbCAS基因序列与生物信息学分析  采用NCBI数据库中ORF finder（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）查找HbCAS基因的ORF（开放阅读框）区，推导出其编码的氨基酸序列;通过在线软件ExPASy的ProtParam（https：//web. expasy.org/protparam/）分析蛋白质的理论分子量和等电点;使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）分析HbCAS基因编码蛋白序列保守结构域;利用Signal P 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM Server V.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）预测HbCAS基因编码蛋白序列的信号肽和跨膜域;使用DeepLoc1.0（http：// www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）预测HbCAS基因编码蛋白的亚细胞定位;蛋白序列比对分析采用NCBI SmartBlast工具，选取与HbCAS蛋白同源的其他植物CAS蛋白序列，利用DNAMAN软件做多序列比对分析，利用MEGA 6.0软件，采用邻接法Neighbor-Joining构建HbCAS蛋白的系统进化树。

1.2.3  实时荧光定量PCR分析  根据测序结果设计HbCAS基因的实时荧光定量PCR的引物。HbCAS-qF：5?TAATCACTCCCGGGAAGACG-，HbCAS-qR：5?GTCACCCTTCTCTCCAAGCT?3，以橡胶树UBC4基因（GenBank登录号：HQ323249.1）为内参基因，设计特异引物，HbUBC4-qF：TCACCCTGAACCTGATAGCC，HbUBC4-qR：TTTCTTTGGTGACGCTGCAA对相应模板进行扩增。

1.3  数据处理

实验所得数据采用SAS软件进行统计分析，使用Origin 2018软件进行数据处理和图表制作，基因相对表达量结果为3次生物学重复的平均值±标准误。

2  结果与分析

2.1  HbCAS基因克隆与序列分析

用拟南芥的CAS序列对橡胶树全基因组数据库做同源比对，获得具有完整ORF的基因序列。在该序列的ORF两端设计特异性引物，采用PCR技术从胶乳cDNA中扩增出的条带与预期片段大小一致（图1）。测序结果显示，该片段长度为1164 bp，ORF长1113 bp。由图2可知，HbCAS蛋白编码370个氨基酸，预测其理论分子量为 40.15 kDa，等电点为8.90。序列分析结果表明，HbCAS基因编码蛋白不具有信号肽和跨膜结构域，主要定位于线粒体，属于色氨酸合成酶（tryptophan synthase beta）超家族。核苷酸序列比对显示，该基因属于CAS家族，将其命名为HbCAS。

2.2  HbCAS蛋白系统进化分析

选取木薯、麻风树、棉花、木槿、可可等10个CAS蛋白与橡胶树HbCAS蛋白进行多序列比对分析，结果表明（图3），HbCAS蛋白与木薯MeCAS氨基酸同源性最高，相似性达91%，其次是麻风树JcCAS蛋白，相似性为90%。进一步利用MEGA 6.0软件将HbCAS蛋白与18个其他物种的CAS蛋白进行系统进化分析，结果表明（图4），HbCAS蛋白与木薯MeCAS、麻风树JcCAS亲缘关系较近，而与葡萄VvCAS、扁桃PdCAS、大麻CsCAS、苦瓜McCAS等亲缘关系较远。

2.3  HbCAS基因的组织表达特性分析

实时荧光定量分析结果表明（图5），HbCAS基因在巴西橡胶树胶乳、树皮、根、稳定叶、衰老叶、雄花、雌花和新梢等组织中均有表达，其中在胶乳中的表达量最高，显著高于在其他组织中的表达量。除胶乳外，HbCAS基因在衰老叶和雄花中的表达量也相对较高，均显著高于在树皮、根、稳定叶、雌花和新梢中的表达，且HbCAS基因在衰老叶中的表达量显著高于雄花;HbCAS基因在树皮、根、稳定叶和雌花中的表达量相对较低，且差异不显著，在树皮、雌花和新梢中的表达也无显著差异。

2.4  HbCAS基因在不同处理下的表达分析

同健康树相比，HbCAS基因在死皮树胶乳中的表达量显著降低（图6）。经胁迫和激素处理后，HbCAS基因的表达均被调节（图7）。在H2O2、MV和低温处理下，HbCAS基因在叶片中的表达量均呈先降低后升高再降低的趋势，其中H2O2和MV处理6 h时，HbCAS基因表达量升高至处理前的2倍左右，达到最大值，6 h后开始显著下降;低温处理3 h和24 h时，HbCAS基因表达量降至最低，48 h后显著升高;在高盐、干旱及乙烯利胁迫下，HbCAS基因的表达量整体呈现上升的趋势，均在48 h显著升高到最高值;MeJA处理下，HbCAS基因表达量整体呈现波动趋势，处理6 h降至最低，约为处理前的1/3;HbCAS基因表达量在SA处理下呈先降低后升高再降低的趋势，处理后12 h表达量最高，约为处理前的2倍，处理后48 h降至处理前的1/2左右;在ABA的处理下，HbCAS基因表达量在处理后3 h升高至最高值，然后呈逐渐下降的趋势，48 h表达量显著降至最低值。

3  讨论

β-CAS是植物体内氰化物解毒的关键酶，在调节植物生长发育及逆境胁迫中扮演重要角色。本研究从橡胶树中克隆了HbCAS基因，该基因编码蛋白与同属大戟科植物的木薯、麻风树CAS蛋白具有较高的序列同源性和较近的亲缘关系，这表明CAS蛋白在进化上高度保守。

HbCAS基因在胶乳、树皮、根、稳定叶、衰老叶、雄花、雌花和新梢等组织中均有表达，其在胶乳中的表达量最高，暗示了该基因可能在胶乳中具有关键功能。同健康树相比，HbCAS基因的表达在死皮树胶乳中受到明显抑制。有研究显示[12-14]，死皮树中β-CAS酶活性显著降低，这与本研究结果类似，暗示了死皮树中氰化物解毒能力下降可能与橡胶树死皮发生有关。

活性氧作为信号分子可调控植物不同的代谢反应，当植物受到逆境胁迫时会大量产生活性氧，导致活性氧的过度积累，从而造成细胞死亡，影响植物正常的生长发育[17-20]。橡胶树死皮发生也被认为与活性氧信号密切相关[21-22]。在本研究中，活性氧处理显著调节了橡胶树HbCAS基因的表達，暗示了HbCAS基因可能通过参与H2O2信号途径进而调节死皮的发生。生产上通过乙烯利刺激来增加胶乳产量。本研究发现，乙烯利刺激显著上调了HbCAS基因的表达，暗示了HbCAS基因可能在乙烯调节的胶乳产生中发挥作用。HbCAS基因的表达也被MeJA、SA和ABA等激素调控，说明HbCAS基因参与了MeJA、SA和ABA等多种激素信号的应答。

此外，HbCAS基因的表达也受多种非生物胁迫调节，如甲基紫精、干旱、低温及盐胁迫等。Yu等[6]发现在烟草中过量表达β-CAS基因能增加植株对盐胁迫的耐性。本研究显示，盐胁迫显著上调了HbCAS基因的表达，推测HbCAS基因可能在橡胶树盐胁迫应答中具有重要功能。干旱胁迫下，HbCAS基因的表达显著上调，Liang等[5]也发现干旱胁迫显著上调烟草叶片和根中β-CAS活性，这与本研究结果类似，暗示了CAS基因参与了干旱胁迫应答。

綜上所述，本研究从巴西橡胶树中克隆了HbCAS基因，该基因ORF长为1113 bp，编码370个氨基酸。HbCAS基因具有组织特异性表达，在死皮树中表达明显下调。H2O2及乙烯利、MeJA、SA和ABA等多种激素调节了HbCAS基因的表达，同时，干旱、低温、甲基紫精、高盐等多种非生物胁迫也调控了HbCAS基因的表达。这些结果暗示了HbCAS基因可能在橡胶树死皮发生、活性氧信号、激素调节及多种非生物胁迫应答中扮演重要角色。本研究为进一步阐明HbCAS基因在橡胶树死皮发生中的功能奠定了理论基础。

参考文献

[1]  柳春梅， 吕鹤书. 生氰糖苷类物质的结构和代谢途径研究进展[J]. 天然产物研究与开发， 2014， 26（2）： 294-299.

[2]  Vetter J. Plant cyanogenic glycosides[J]. Toxicon， 2000， 38（1）： 11-36.

[3]  Zagrobelny M， Bak S， M?ller B L. Cyanogenesis in plants and arthropods[J]. Phytochemistry， 2008， 69（7）： 1457-1468.

[4]  Jost R， Berkowitz O， Wirtz M， et al. Genomic and functional characterization of the oas gene family encoding O-acetylser?ine （thiol） lyases， enzymes catalyzing the final step in cysteine biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Gene， 2000， 253（2）： 237-247.

[5]  Liang W S. Drought stress increases both cyanogenesis and β-cyanoalanine synthase activity in tobacco[J]. Plant Science， 2003， 165（5）： 1109-1115.

[6]  Yu L L， Liu Y， Liu C J， et al. Overexpressed β-cyanoalanine synthase functions with alternative oxidase to improve tobacco resistance to salt stress by alleviating oxidative damage[J]. FEBS Letters， 2020， 594（8）： 1284-1295.

[7]  García I， Rosas T， Bejarano E R， et al. Transient transcriptional regulation of the CYS-C1 gene and cyanide accumulation upon pathogen infection in the plant immune response[J]. Plant Physiology， 2013， 162（4）： 2015-2027.

[8]  García I， José-María C， Blanca V， et al. Mitochondrial β-cyanoalanine synthase is essential for root hair formation in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell， 2010， 22（10）： 3268- 3279.

[9]  Amiola R O， Ademakinwa A N， Ayinla Z A， et al. Purification and biochemical characterization of a β-cyanoalanine synthase expressed in germinating seeds of Sorghum bicolor （L.） moench[J]. Turkish Journal of Biochemistry， 2018， 43（6）： 638-650.

[10]      Lieberei R. South American leaf blight of the rubber tree （Hevea spp.）： new steps in plant domestication using physiological features and molecular markers[J]. Annals of Botany， 2007， 100（6）： 1125-1142.

[11]      Kongsawadworakul P， Viboonjun U， Romruensukharom P， et al. The leaf， inner bark and latex cyanide potential of Hevea brasiliensis： Evidence for involvement of cyanogenic glucosides in rubber yield[J]. Phytochemistry， 2009， 70（6）： 730-739.

[12]      Moraes L A C， Moraes V H F， Moraes A. Effect of the cyanogenesis on the incompatibility of crow clones of Hevea spp. budded onto IPA 1[J]. Pesquisa Agropecuaria Brasileira， 2002， 37（7）： 925-932.

[13]      Krishnakumar R， Ambily P K， Jacob J. Plant hormones and oxidative stress in Hevea brasiliensis[J]. Journal of Plantation Crops， 2014， 42（1）： 86-93.

[14]      Chrestin H， Sookmark U， Trouslot P， et al. Rubber tree （Hevea brasiliensis） bark necrosis syndrome III： a physiological disease linked to impaired cyanide metabolism[J]. Plant Disease， 2004， 88（9）： 1047.

[15]      Zhu J H， Zhang Q Q， Wu R， et al. HbMT2， an ethephon-induced metallothionein gene from Hevea brasiliensis responds to H2O2 stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2010， 48（8）： 710-715.

[16]      Hao B Z， Wu J L. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis： induction by exogenous jasmonic acid and linolenic acid[J]. Annals of Botany， 2000， 85（1）： 37-43.

[17]      Apel K， Hirt H. Reactive oxygen species： metabolism， oxidative stress， and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology， 2004， 55（1）： 373-399.

[18]      Camejo D， Guzmán-Cede?o ?， Moreno A. Reactive oxygen species， essential molecules， during plant-pathogen interactions[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2016， 103： 10-23.

[19]      Choudhury F K， Rivero R M， Blumwald E， et al. Reactive oxygen species， abiotic stress and stress combination[J]. Plant Journal， 2017， 90（5）： 856-867.

[20]      Segal L M， Wilson R A. Reactive oxygen species metabolism and plant-fungal interactions[J]. Fungal Genetics and Biology， 2018， 110： 1-9.

[21]      Chrestin H. Biochemical aspects of bark dryness induced by overstimulation of rubber trees with ethrel[M]//DAuzac J， Jacob J L， Chrestin H. eds. Physiology of rubber tree latex： The laticiferous cell and latex-a model of cytoplasm. USA， Florida， Boca Raton： CRC Press， 1989： 431-439.

[22]      Li D J， Deng Z， Chen C L， et al. Identification and characterization of genes associated with tapping panel dryness from Hevea brasiliensis latex using suppression subtractive hybridization[J]. BMC Plant Biology， 2010， 10（1）： 1-12.

責任编辑：黄东杰