谢俊康，陈 虎，谭健晖，罗群凤，汪 挺，杨章旗

（1.广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530002；2.广西师范大学，广西 桂林 541006）

马尾松Pinus massoniana是广泛分布于我国南方的材脂兼用树种，其具有适应性强，经济价值高等特点[1]。由于近些年马尾松人工纯林的面积不断扩大、气候变化及防范意识不强等原因，松树病虫害也开始频繁暴发且防治效果并不理想[2]。挥发性物质可以作为信号介导植物对植食性昆虫的防御反应，且在植物—害虫—天敌的三级营养关系中发挥作用[3]。植物产生和释放的挥发性物质对于植食性昆虫及其天敌的定向、取食、聚集、产卵等诸多行为都产生明显影响[4-5]。研究表明，挥发性物质在针叶树预防昆虫和病原体中发挥着重要的作用，当马尾松受到昆虫胁迫时会引起自身的生理应激反应，释放出挥发性物质是应对昆虫最直接有效的手段[6]，挥发性萜类化合物是马尾松中最重要的抗虫物质，其可以通过抑制昆虫取食、毒害昆虫及吸引昆虫天敌等方式达到抗虫目的[7-9]。张苏芳等[10]研究了马尾松毛虫常灾区、偶灾区和无灾区松针挥发物的特征，结果表明挥发性有机化合物与马尾松毛虫暴发之间具有相关性，松针挥发物的组成比例可能影响松毛虫的暴发情况。研究马尾松松针挥发物成分及其变化规律，可以为马尾松病虫害防治提供一定的参考意义。

信号物质在植物的生长过程中起到非常重要的作用，常见的信号物质有水杨酸Salicylic acid（SA）、赤霉素Gibberellin（GA）、乙烯Ethylene（ET）、茉莉酸Jasmonic acid（JA）、过氧化氢Hydrogen peroxide（H2O2）和脱落酸Abscisic acid（ABA）等。有研究表明，GA 对打破短尾越橘种子休眠、提高发芽率、提早发芽均有明显效果[11]，在酸橙Citrus aurantium叶片上喷施GA 和SA 后，酸橙叶片中总酚和总黄酮含量显著上升[12]。目前，内源信号物质在植物体内的作用机制、含量及变化规律已有了较为深入的研究[13-14]，但是针对植物次级代谢产物在外源信号物质刺激下响应情况的研究及报道较少。王立春等[15]研究了外源茉莉酸甲酯对马尾松松针萜烯类挥发物及马尾松毛虫生长发育的影响，结果表明马尾松毛虫幼虫的取食量、排粪量、对食物的消耗和利用指数随着茉莉酸甲酯喷施浓度的升高而降低，而死亡率则表现出与上述指标相反的规律，这说明外源茉莉酸甲酯能够诱导植物的抗虫性。本研究运用外源信号物质喷洒马尾松幼苗，研究在不同种类及浓度的外源信号物质处理下，松针挥发性物质的响应情况，可以为松树抗病虫害研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为长势一致的10月龄马尾松全同胞家系19-307（PG1×GZ484）苗木，实验材料来自广西壮族自治区林业科学研究院松树苗圃。

1.2 试验方法

1.2.1 外源信号物质处理

采 用SA、GA、ET、H2O2、JA 和ABA 共6种信号物质对马尾松苗木进行处理，每种信号物质采用4 种不同浓度，具体浓度见表1。实验步骤如下：每天早晨8:00—9:00 将配制好的100 mL 信号物质对实验苗木进行喷施，以茎和针叶滴水为宜，共处理7 d，以喷施蒸馏水为对照组。每个处理重复3 次，每个重复3 株苗。在第8 天时，统一采取苗木中上部老熟针叶，装入密封袋，放入冰盒，带回实验室备用。

表1 不同信号物质浓度†Table 1 Concentration of different signal substances

1.2.2 松针挥发物组分分析

采取固相微萃取- 气相色谱- 质谱联用（SPME-GC-MS）对松针挥发性物质进行测定[16]。将相同处理下的3 株幼苗的针叶混合并剪碎，称取0.50 g 剪碎后的针叶放置于10 mL 顶空瓶中，加入适量的无水硫酸钠（干燥剂），插入老化后的萃取头，在75℃恒温浴锅内萃取15 min 后，在Bruker 气相色谱三重四级杆质谱仪（SCION SQ-TQ）中解析3 min 后进行GC-MS 分析。其中气相色谱（GC）条件：色谱柱为DB-5 毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），检测器为氢火焰离子检测器（FID），载气为高纯氦气（99.999%），不分流，柱前压49.5 Pa，柱流量1 mL·min-1。程序升温方法为初始温度40℃并保持5 min，以5℃·min-1的升温速度升至150℃，然后以2℃·min-1的升温速度升至160℃，最后再以10℃·min-1的升温速度升至250℃，保持5 min。进样口和检测器温度均为250℃。质谱（MS）条件：电子轰击源为EI，电子能量70 eV，离子源温度250℃；接口温度250℃，扫描质量范围40～450 amu，扫描间隔0.5 s，扫描时间设置为46 min。

1.3 数据处理

通过将所得质谱图与系统中NIST 数据库的标准图谱比对并结合相关文献[17-20]对针叶挥发物组分进行定性分析。采用面积归一化法对松针挥发物组分进行定量分析。采用Origin 8.5 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 松针挥发物组分分析

对照组马尾松幼苗针叶挥发物成分及其相对含量如表2所示。经GC-MS 共检测和鉴定出松针挥发物成分22 种，其相对含量占总量的99.241%。其中单萜组分有α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯和异松油烯，单萜成分约占整体的50.407%。检测和鉴定出的倍半萜成分有γ-榄香烯、胡椒烯、β-榄香烯、长叶烯、石竹烯、α-金合欢烯、葎草烯、β-荜澄茄烯、1-乙烯基-1-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-（1-甲基亚乙基）-环己烷、α-摩勒烯、γ-摩勒烯和δ-杜松烯，倍半萜含量约占整体的46.104%。此外，对照组松针挥发物中还鉴定出了少量酯类化合物（甲酸芳樟酯和乙酸龙脑酯）及醇类化合物（松油醇和库贝醇）。对照组挥发物中单萜的相对含量略高于倍半萜，相对含量较高的组分（大于2%）有α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯、葎草烯、β-荜澄茄烯和1-乙烯基-1-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-（1-甲基亚乙基）-环己烷。

表2 对照组马尾松幼苗松针挥发物组分Table 2 Volatile components of Pinus massoniana seedlings in the control group

2.2 外源信号物质对松针挥发物的影响

通过分析外源信号物质处理下对马尾松幼苗松针挥发物组分的影响。结果表明，不同种类及浓度外源信号物质处理下挥发性物质的种类不变，外源信号物质处理下只改变了不同挥发物的相对含量。这说明挥发性物质的合成主要是受遗传控制的，通过改变环境因素可以影响其含量变化[21]。下面研究了相对含量较高组分（大于2%）在外源信号物质处理下的变化情况。

2.2.1 SA 对马尾松幼苗松针挥发物的影响

不同浓度的SA处理下，马尾松幼苗松针挥发物组分相对含量的变化情况如图1所示。当以浓度不超过200 mg·L-1的SA 处理时，挥发物中单萜、α-蒎烯和β-蒎烯的相对含量均低于对照组，当SA的浓度为400 mg·L-1时，单萜、α-蒎烯和β-蒎烯的相对含量高于对照组。SA 的浓度为100 mg·L-1时，单萜、α-蒎烯和β-蒎烯的相对含量最低。倍半萜、石竹烯和葎草烯的相对含量变化趋势与α-蒎烯相反。SA 的处理浓度为100 mg·L-1时，石竹烯和葎草烯的相对含量最高且高于对照组。SA 处理浓度为400 mg·L-1时，石竹烯和葎草烯的相对含量下降程度最明显。SA 处理下可以提高β-荜澄茄烯的相对含量，在浓度为400 mg·L-1条件下β-荜澄茄烯的相对含量增加了1 倍以上。1-乙烯基-1-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-（1-甲基亚乙基）-环己烷的相对含量随着SA 处理浓度的增加而下降，且仅在处理浓度为400 mg·L-1时，其相对含量低于对照组。

图1 不同浓度SA 处理对马尾松幼苗松针挥发物的影响Fig.1 Effect of SA treatment with different concentrations on the volatiles of pine needles in Pinus massoniana seedlings

2.2.2 GA 对马尾松幼苗松针挥发物的影响

不同浓度的GA 处理下，马尾松幼苗松针挥发物组分相对含量的变化情况如图2所示。GA 处理后挥发物中单萜和倍半萜的变化趋势与SA 处理相似。仅在GA 浓度为200 mg·L-1的条件下，挥发物中单萜、α-蒎烯和β-蒎烯的相对含量高于对照组，当GA 的浓度为100 mg·L-1时，单萜、α-蒎烯和β-蒎烯的相对含量均处于最低值，其中α-蒎烯的相对含量由对照组的44.707%显著下降至35.257%。在GA 浓度为200 mg·L-1时，石竹烯和葎草烯的相对含量均低于对照组，其余浓度条件下均高于对照组。β-荜澄茄烯的相对含量随着GA浓度增加而增加（仅在GA 浓度为50 mg·L-1条件下其相对含量略小于对照组）。1-乙烯基-1-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-（1-甲基亚乙基）-环己烷对不同浓度GA 处理响应较为敏感，GA 浓度为50 和100 mg·L-1条件下其相对含量明显上升，GA 浓度增至150 和200 mg·L-1后其相对含量明显下降。

图2 不同浓度GA 处理对马尾松幼苗松针挥发物的影响Fig.2 Effect of GA treatment with different concentrations on the volatiles of pine needles in Pinus massoniana seedlings

2.2.3 ET 对马尾松幼苗松针挥发物的影响

不同浓度的ET 处理下，马尾松幼苗松针挥发物组分相对含量的变化情况如图3所示。经不同浓度ET 处理后，挥发物中单萜和α-蒎烯的相对含量均下降，倍半萜的相对含量均有所上升，其中ET 浓度为200 mg·L-1时，单萜和α-蒎烯的相对含量最低。当ET 浓度高于50 mg·L-1时，β-蒎烯相对含量均高于对照组，且在ET 浓度为100 mg·L-1时到达最高。在ET 浓度不高于200 mg·L-1条件下，石竹烯与葎草烯的相对含量均高于对照组，当ET浓度为400 mg·L-1时，石竹烯与葎草烯的相对含量均低于对照组。仅在ET 浓度为100 mg·L-1条件下β-荜澄茄烯的相对含量略低于对照组，ET 浓度为200 mg·L-1条件下β-荜澄茄烯的相对含量达到最大，且高于对照组1倍以上。不同浓度ET处理后，1-乙烯基-1-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-（1-甲基亚乙基）-环己烷的相对含量较对照组而言均下降，ET 浓度为200 mg·L-1其相对含量下降幅度最大。

图3 不同浓度ET 处理对马尾松幼苗松针挥发物的影响Fig.3 Effect of ET treatment with different concentrations on the volatiles of pine needles in Pinus massoniana seedlings

2.2.4 H2O2 对马尾松幼苗松针挥发物的影响

不同浓度的H2O2处理下，马尾松幼苗松针挥发物组分相对含量的变化情况如图4所示。不同浓度H2O2处理后，单萜和α-蒎烯的相对含量相较于对照组均有所下降，在H2O2浓度较低（50 和100 mg·L-1）的情况下，单萜和α-蒎烯的相对含量下降较为明显。β-蒎烯相对含量仅在H2O2浓度为200 mg·L-1条件下高于对照组，其余浓度下β-蒎烯相对含量较对照组均有所下降。不同浓度H2O2处理下石竹烯相对含量改变程度较小，仅在低浓度下（50 mg·L-1）石竹烯相对含量略高于对照组，其余浓度下略低于对照组。随着H2O2浓度的增加，葎草烯的相对含量呈先降低后升高趋势，且低浓度（50 mg·L-1）和高浓度（400 mg·L-1）条件下葎草烯的相对含量高于对照组。不同浓度H2O2处理下β-荜澄茄烯的相对含量均高于对照组，且随着H2O2浓度的增加，其增加的幅度也越来越大，在H2O2浓度为400 mg·L-1时，β-荜澄茄烯的相对含量由对照组的3.927%增至9.617%。H2O2浓度为400 mg·L-1时1-乙烯基-1-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-（1-甲基亚乙基）-环己烷相对含量低于对照组，较低H2O2浓度下其相对含量均高于对照组。

图4 不同浓度H2O2 处理对马尾松幼苗松针挥发物的影响Fig.4 Effect of H2O2 treatment with different concentrations on the volatiles of pine needles in Pinus massoniana seedlings

2.2.5 JA 对马尾松幼苗松针挥发物的影响

不同浓度的JA 处理下，马尾松幼苗松针挥发物组分相对含量的变化情况如图5所示。不同浓度JA 处理后，挥发物中单萜和α-蒎烯的相对含量显著下降，倍半萜相对含量显著升高，且JA 浓度越高单萜和α-蒎烯下降程度越大。石竹烯和葎草烯随JA 浓度变化趋势与α-蒎烯相反，随着JA浓度增大，石竹烯和葎草烯相对含量均呈现逐渐增大趋势。β-荜澄茄烯相对含量随JA 浓度的改变趋势不明显，在JA 浓度为20 和100 mg·L-1时其相对含量显著增加。在JA 浓度为50 和200 mg·L-1时其相对含量略低于对照组。不同浓度JA 对1-乙烯基-1-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-（1-甲基亚乙基）-环己烷相对含量的影响与H2O2相似，JA 浓度较高（100 和200 mg·L-1）时，其相对含量低于对照组，JA 浓度较低（20 和50 mg·L-1）时，其相对含量高于对照组。

图5 不同浓度JA 处理对马尾松幼苗松针挥发物的影响Fig.5 Effect of JA treatment with different concentrations on the volatiles of pine needles in Pinus massoniana seedlings

2.2.6 ABA 对马尾松幼苗松针挥发物的影响

不同浓度的ABA 处理下，马尾松幼苗松针挥发物组分相对含量的变化情况如图6所示。经不同浓度ABA 处理后挥发物中单萜和α-蒎烯的相对含量显著下降，倍半萜相对含量显著上升，ABA 浓度为75 mg·L-1时，单萜的相对含量由对照组的50.407%下降至23.711%。β-蒎烯的相对含量仅在ABA 处理浓度为25 mg·L-1时高于对照组。石竹烯和葎草烯的相对含量均随ABA 处理浓度的增加呈现出增加的趋势，石竹烯和葎草烯的相对含量分别在ABA 浓度为100 和75 mg·L-1时到达最高。经过不同浓度ABA 处理后，β-荜澄茄烯的相对含量均高于对照组，且ABA 浓度为75 mg·L-1时β-荜澄茄烯的相对含量组高，由对照组的3.927%增至13.346%。不同浓度ABA 对1-乙烯基-1-甲基-2-（1-甲基乙烯基）-4-（1-甲基亚乙基）-环己烷相对含量的影响与JA 和H2O2相似，ABA 浓度较高（100 mg·L-1）时，其相对含量低于对照组，ABA 浓度低于100 mg·L-1时，其相对含量高于对照组。

图6 不同浓度ABA 处理对马尾松幼苗松针挥发物的影响Fig.6 Effect of ABA treatment with different concentrations on the volatiles of pine needles in Pinus massoniana seedlings

通过分析不同种类及浓度的信号物质对马尾松幼苗松针挥发性物质的影响，研究发现，α-蒎烯的变化趋势与单萜的变化趋势往往相近。以所有实验组及对照组中α-蒎烯的相对含量为横坐标，以对应单萜的相对含量为纵坐标，对α-蒎烯和单萜的相对含量进行线性拟合，结果如图7所示。由图7可以直观的看出，绝大部分点均落在拟合曲线上，少部分点分布在拟合曲线附近，没有偏离拟合曲线较远的点。通过计算得到的拟合方程为y=1.125x+0.325，其中R2=0.996 64，线性相关性较好。大部分处理条件下实验组中单萜和α-蒎烯的相对含量均低于对照组。经过外源信号物质处理后，可以改变松针中单萜和α-蒎烯的相对含量，但是α-蒎烯和单萜的相对含量的关系不变，具体原因尚不清楚，有待进一步实验探讨。同样对β-蒎烯与单萜，石竹烯、葎草烯等与倍半萜进行拟合，它们的线性关系并不理想。

图7 α-蒎烯和单萜相对含量的线性拟合图Fig.7 Linear fitting diagram between relative contents of α-pinene and monoterpene

3 结 论

通过外源信号物质处理下可以改变挥发物组成，在不同信号物质、不同用量下，挥发物组分变化不同。实验结果表明，仅在浓度较高的GA和SA 处理条件下，单萜和α-蒎烯相对含量有所上升。不同浓度ET 处理后，单萜和α-蒎烯相对含量均降低，但它们的变化程度不大。H2O2在较低的处理浓度下，单萜和α-蒎烯相对含量降低明显。JA 和ABA 处理后，单萜和α-蒎烯相对含量显著降低。可以通过外源信号物质的作用，调节松针挥发物组成以达到抗病虫害的目的，进而减缓长期药物喷施带来的环境污染。

4 讨 论

马尾松松针中最主要的挥发物是单萜和倍半萜，他们的合成途径分别为：通过MEP 途径在叶绿体中以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为底物经磷酸甲基赤藓糖形成单萜[22-23]和通过MVA 途径在细胞质中以乙酰辅酶A 为底物经甲羟戊酸形成倍半萜[24-25]。马尾松在受到生物或非生物胁迫时，其挥发性物质的释放也会产生应激性的变化，在不同的条件下能够合成与释放不同组合的萜类挥发物[26]。

通过外源信号物质处理可以改变马尾松松针挥发物组成，诱发马尾松的抗虫性能。邓文红等[27]研究了茉莉酸甲酯和萜烯混合物熏蒸对马尾松抗虫性的影响，结果表明茉莉酸甲酯和萜烯混合物熏蒸可以代替虫害作用，诱导植物防御基因的表达，产生系统诱导抗性。马尾松在轻度虫害胁迫下，α-蒎烯含量在损伤枝、姊妹枝、系统上枝和系统下枝均下降，α-蒎烯仅仅是马尾松松针挥发物中主要成分，其与马尾松抗虫性能的关系并不密切，其在抗虫中的作用尚未报道[28]。在本研究中，大多数处理条件下α-蒎烯相对含量也呈现下降趋势，部分处理条件下α-蒎烯相对含量下降明显。有理由相信在经过信号物质处理后，引发松针挥发物中抗虫组分含量增加从而诱导马尾松抗虫性能的产生。

外源信号物质处理可以引起松针中挥发物各组分的变化，挥发物组分变化与外源信号物质的种类及浓度有关。外源信号物质刺激是一种潜在的有效预防松树病虫害的手段，可以通过外源信号物质的作用，调节松针挥发物组成以达到抗病虫害的目的。有研究表明，马尾松经人工剪叶后其挥发物的相对含量提高，人工剪叶模拟虫害也可以达到调控马尾松毛虫种群的目的，减轻松毛虫为害，延缓其爆发周期[28-29]。在实际生产中可以修枝剪叶与外源信号物质诱导同时进行，以达到更好的抗虫效果。

本研究使用不同信号物质处理马尾松幼苗松针，通过SPME-GC-MS 分析不同处理后松针挥发物变化情况，为信号物质诱导马尾松抗虫性提供理论支撑，接下来需使用不同处理后的针叶喂食松毛虫等松树主要害虫，研究松毛虫的进食情况、进食后松毛虫的生长状况及其排泄物等，探究信号物质诱导马尾松抗虫的机理。