赵海静，邱绮，欧阳能勇，朱玉琴，王文军

(中山大学孙逸仙纪念医院生殖中心，广州 510120)

人类辅助生殖的常规体外受精(IVF)过程中，正常受精的定义是受精后16～20 h内观察到受精卵中有两个清晰的原核(2 pronucleus，2PN)及两个极体(2 polar body，2pb)[1]。非正常形态学标准的受精卵，例如零原核(0PN)、单原核(1PN)、三个原核或多个原核(3PN或多PN)伴随有或无第二极体，统称为异常受精[2]。其中受精卵含有三个或三个以上原核称为多精子受精，主要原因是受精时有两个或两个以上精子穿入卵母细胞。导致多条精子进入卵母细胞的原因有以下几个方面：(1)卵母细胞不成熟或过熟；(2)精子浓度过高；(3)透明带异常；(4)卵泡液中高孕酮水平；(5)血清中高雌激素水平。在常规IVF过程中，多精子受精的发生率可达2%～10%，被认为是导致早期胚胎死亡、流产和胎儿遗传学疾病的主要原因[1]，也是导致IVF周期整体失败的一个因素[3]。尤其是当患者只获得一个卵母细胞时，其受精结局更为重要，若为多精子受精，则无可利用胚胎，本次治疗周期失败，给患者造成一定的心理负担和经济损失。

临床上3PN或多PN胚胎已经被确定为染色体异常，因此多精子受精直接否认了该胚胎的可利用性。作为多精子受精原因之一的“血清中高雌激素水平”给我们以启发。本研究旨在分析常规IVF周期中，仅获单一卵母细胞周期的正常受精与多精子受精者血清中各种激素水平之间的差异，探究对受精结局可能产生影响的激素及其浓度截断值，为减少仅获的单一卵母细胞发生多精子受精，增加胚胎移植及妊娠机会提供参考。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2015年1月至2019年12月在本中心行常规IVF助孕且仅获得一个卵母细胞的患者临床资料。

纳入标准：(1)仅获一个卵母细胞(单一卵母细胞)，且常规IVF助孕；(2)D1单一卵母细胞原核观察为2PN受精；(3)D1单一卵母细胞原核观察为3PN或多PN受精。

排除标准：(1)D1单一卵母细胞形态学观察为MI、GV、退化或空透明带；(2)D1单一卵母细胞原核观察为0PN受精(MII或2pb)；(3)D1单一卵母细胞原核观察为1PN受精。

本研究共纳入433例患者，根据单一卵母细胞受精结局分为IVF-2PN组(n=326)和IVF-3PN组(n=107)。

二、研究方法

1.促排卵方案及取卵：入组患者所采用的控制性促排卵方案包括微刺激方案、轻微刺激方案、自然/半自然方案、黄体期促排卵方案、拮抗剂方案等多种用药方案。阴道B 超监测卵泡生长情况，当B超监测有1～2个卵泡直径≥18 mm时肌肉注射HCG(珠海丽珠)10 000 U，36～37 h后取卵。

2.体外受精、原核观察：获卵后经培养4～6 h行常规IVF，所有精液经过优化处理后，均调至统一的受精浓度0.3×106/ml。受精16～20 h后评估原核情况，受精卵中有一个雌原核和一个雄原核的归于IVF-2PN组；受精卵中有3个或3个以上原核的归于IVF-3PN组。

3.评价指标：记录两组患者年龄、不孕年限、助孕次数、体质量指数(BMI)、基础激素水平(FSH、LH、E2、PRL)；促排卵中Gn总量，Gn日血清FSH、LH、E2水平，HCG总量，HCG日血清FSH、LH、E2水平。

4.激素浓度截断值计算：通过受试者操作特征曲线(ROC curve)分别计算血清基础E2、Gn日血清LH和E2、HCG日血清LH的浓度截断值。

三、统计学分析

结 果

一、患者基本资料

两组患者间年龄、不孕年限、BMI、基础FSH、基础LH、基础PRL水平均无统计学差异(P>0.05)；而IVF-3PN组的基础E2水平显著高于IVF-2PN组(P<0.01)(表1)。

表1 两组患者基本资料比较(-±s)

二、两组患者促排卵的情况

比较患者在控制性促排卵治疗期间的主要信息，如Gn总量、Gn日血清FSH、LH、E2水平、HCG总量、HCG日血清FSH、LH、E2水平。结果显示，与IVF-2PN组相比，IVF-3PN组Gn日血清LH和E2水平显著升高(P<0.01)，HCG日血清LH水平显著升高(P<0.05)，而Gn总量显著降低(P<0.05)(表2)。

表2 两组患者促排卵情况比较(-±s)

三、Gn总量、不同时间点血清LH和E2水平与单一卵母细胞多精子受精结局的相关性

以Gn总量、每种激素水平为自变量，以受精结局(2PN或3PN)为因变量，用Logistic 回归模型分析单一卵母细胞发生多精子受精的危险因素。结果显示，基础E2水平、Gn总量、Gn日血清LH和E2水平、HCG日血清LH水平与单一卵母细胞多精子受精均存在显著相关性(P<0.05)(表3)。

表3 单一卵母细胞多精子受精的相关因素Logistic回归分析

四、不同时间点血清LH和E2浓度的截断值

以各种激素水平为自变量，单一卵母细胞受精结局(2PN或3PN)为因变量，通过ROC曲线来判断各个激素浓度截断值。分析结果表明：血清基础E2浓度截断值为258.74 pmol/L[AUC=0.533，95%CI(0.482，0.583)，P=0.200]；Gn日血清LH浓度截断值为6.32 U/L[AUC=0.583，95%CI(0.534，0.632)，P=0.001]、E2浓度截断值为471.60 pmol/L[AUC=0.575，95%CI(0.526，0.624)，P=0.003]；HCG日血清LH浓度截断值为3.28 U/L[AUC=0.591，95%CI(0.542，0.639)，P=0.000](图1)。

A：基础血清E2浓度；B：Gn日血清LH浓度；C：Gn日血清E2浓度；D：HCG日血清LH浓度图1 不同时间点血清激素水平预测单一卵母细胞多精子受精的ROC曲线

将以上各个激素水平联合起来作为多因素进行ROC曲线分析，结果为[AUC=0.631，95%CI(0.569，0.693)，P=0.000](图2)，AUC面积增加且P<0.05，说明各激素浓度联合起来的预测效果较好。

图2 不同时间点血清激素水平联合预测单一卵母细胞多精子受精的ROC曲线

五、患者不同时间点血清LH和E2浓度对其单一卵母细胞受精结局的影响

根据前面计算的不同时间点血清LH和E2截断值，将患者进行亚分组：激素低浓度组(<截断值)和激素高浓度组(≥截断值)。比较不同亚组间的IVF-2PN及IVF-3PN比例。结果显示，不同激素高浓度组中的IVF-2PN比例均显著低于激素低浓度组(P<0.05)，而IVF-3PN比例均显著高于激素低浓度组(P<0.05)(表4)。

表4 激素低浓度组与激素高浓度组中IVF-2PN和IVF-3PN的比例[n(%)]

讨 论

多精子受精对胚胎发育是灾难性的伤害[4]。目前研究表明，卵母细胞质量、透明带(zona pellucida，ZP)分子结构改变、皮质反应改变、HCG日血清高E2水平、卵泡液中高孕酮水平等因素影响多精子受精的发生[5-9]。卵母细胞质量的主要影响因素包括女方年龄、促排卵方案及卵泡大小。前期研究中我们将女方年龄、促排卵方案分别与单一卵母细胞受精结局进行Logistic回归分析，结果显示：女方年龄(P=0.546)及促排卵方案(P=0.214)与单一卵母细胞的受精结局均无显著相关性(P>0.05)。本研究收集的病例，取卵时卵泡直径均≥18 mm，说明卵母细胞的成熟程度较好。有文献报道，卵母细胞ZP厚度及其完整性与血清雌激素水平有关，而ZP质量与精子穿透密切相关，如果ZP质量受到破坏，会使多精子受精的发生率增加[9]。Loret De Mola等[10]指出，血清高雌激素水平会减少ZP中一种糖原(PAS)染色阳性的物质，从而引起ZP结构改变。依据我们的研究结果推测，基础血清E2水平和Gn日血清E2水平的显著提高使单一卵母细胞ZP结构异常，导致多精子受精的发生。磷脂酰肌醇信号通路在皮质反应中起着重要作用，该通路的改变可能会破坏膜阻断，导致多精子受精发生[11]。张颖等[9]的研究结论是HCG日较高E2水平与3PN发生有关，而我们的结果是IVF-3PN组HCG日血清LH水平显著提高，但两者并不矛盾，因为LH可作用于卵泡内膜细胞上的LH受体，促进内膜细胞利用胆固醇合成和分泌雄激素。分泌出的雄激素经过扩散进入颗粒细胞后，会被颗粒细胞中的芳香化酶转化成E2[12]，说明HCG日血清高LH水平间接意味着血清高E2水平。有文献报道Gn用量偏小的周期中更易发生多精子受精[13]，本研究中IVF-3PN组Gn总量显著低于IVF-2PN组(P<0.05)，支持这一结论。

除了卵母细胞相关因素外，多精子受精还与精子浓度有关[14]，精子浓度过高导致多精子受精频率增加，但是降低精子浓度则造成精子穿透率减少。然而Uhler等[15]的研究中使用不同浓度的前向运动精子进行比较，发现精子浓度增加并未增加多精子受精的发生风险。本研究中，单一卵母细胞体外受精时均调至统一的授精浓度0.3×106/ml，因此多精子受精的发生与精子浓度的关联不大。

本研究中，IVF-3PN组患者的基础E2水平、Gn日血清LH、E2水平和HCG日血清LH水平均显著高于IVF-2PN组(P<0.05)，提示这些激素可能与单一卵母细胞多精子受精有关。对以上各时间点激素水平进行Logistic回归分析，结果提示它们与单一卵母细胞多精子受精之间均存在显著相关性(P<0.05)。通过ROC曲线计算出各激素浓度截断值并根据截断值进行亚分组分析，在不同时间点的各个激素中，激素高浓度组的IVF-2PN比例均显著低于激素低浓度组(P<0.05)，而IVF-3PN比例均显著高于激素低浓度组(P<0.05)，表明当血清基础E2水平、Gn日血清LH、E2水平和HCG日血清LH水平分别高于对应的浓度截断值时，可能会增加单一卵母细胞发生多精子受精的风险，但相应的分子机制需要进一步的探索验证。

本研究从“血清激素水平”这一角度，探究了在常规IVF周期中，患者血清中LH和E2水平与其单一卵母细胞受精结局之间的可能相关性。血清激素水平对单一卵母细胞多精子受精的预测价值需要综合考虑LH和E2两种激素浓度的动态变化。而ZP分子结构的改变、卵泡液中孕酮水平的差异将在后续的前瞻性研究中继续探讨。