苏文全，金荣，耿运玲，杜雅薇，吴圣贤

(北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是慢性炎症性疾病。炎症反应在As斑块的形成、破裂、糜烂、栓塞及诱发急性心脑血管事件中有着重要作用[1]，而斑块坏死脂质核心中的巨噬细胞源性泡沫细胞是炎症反应的主要来源[2]。四妙勇安汤是解毒活血法的经典方剂，现临床上已广泛用于治疗As相关性疾病[3]。然而在As抗炎治疗中，相对于其他炎症因子，血清高敏-C反应蛋白(high-sensitivity C-responsibility protein，hs-CRP)水平的降低是指南推荐的最有效、独立的治疗目标[4]。同时我们在临床上亦发现，四妙勇安汤是降低hs-CRP的潜在中药方剂，运用2周能有效降低As患者的血清hs-CRP水平，稳定斑块。本实验以血清hs-CRP水平的有效降低为抗炎疗效的基础，围绕“NF-κB/IL-1β/CRP”通路，具体探讨四妙勇安汤抑制As斑块炎症反应的作用及可能机制，以期为四妙勇安汤降低hs-CRP及抑制As炎症反应提供支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康7～8周龄雄性ApoE-/-小鼠，35只，体质量20～25 g，由北京大学医学部实验动物中心提供。实验室环境温度恒定22～24 ℃，湿度50%，明暗交替，自由采食。本研究获北京中医药大学东直门医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与主要试剂

辛伐他汀(舒降之，默沙东公司生产，批号：20080224)；四妙勇安汤由金银花、玄参、当归、生甘草组成，免煎颗粒，由北京中医药大学东直门医院提供；高脂饲料(21%脂肪、0.15%胆固醇)，购自京科奥协力饲料有限公司；小鼠高敏C反应蛋白ELISA试剂盒购自美国RapidBio Lab公司(进口分装，批号2B900s)，IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，二抗购自美国ZYMED公司Sp系列试剂盒。

1.3 主要仪器

4634旋转式组织脱水机、5235组织包埋机、pM-401石蜡溶蜡箱、CRM-440切片机，均为日本SAKURA公司生产；ICAp-9000型STAR72600酶标仪为美国Jarrel-ASH公司生产，美国Image-pro plus Version 6.0(Ipp6.0)图像分析软件。

1.4 模型制备及分组给药

35只ApoE-/-小鼠先给予普通饲料喂养7～8周，后改用高脂饲料喂养13周。随机处死5只，于光镜下确认小鼠心脏主动脉根部AS斑块形成。随后将其余30只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、辛伐他汀组、四妙勇安汤组，每组10只，继续给予高脂饲料喂养。分组后模型组按体质量比例生理盐水灌胃，辛伐他汀组给药剂量为3.03 mg/(kg·d)，蒸馏水溶解灌胃。四妙勇安汤组给药剂量为金银花4.505 g/(kg·d)、玄参4.505 g/(kg·d)、当归3.003 g/(kg·d)、生甘草1.501 g/(kg·d)，蒸馏水溶解灌胃。10只C57BL/6J小鼠为正常组，全程普通饮食饲养，按体质量比例生理盐水灌胃。各组每日给药1次，连续给药19周后取材。

1.5 标本采集及处理

成模后禁食12 h取材，采用腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉后摘取眼球取血，离心后血清标本存于-20 ℃冰箱。消毒皮肤，打开胸腔，暴露组织，在无菌条件下取出心脏及主动脉，并在心底部位纵向切开小口(以便固定液渗透)，生理盐水涮洗，4%多聚甲醛固定。

1.6 血清hs-CRP水平的检测

按照试剂盒操作说明，采用经典酶联免疫法测定小鼠血清hs-CRP水平。

1.7 免疫组化法检测小鼠主动脉根部AS斑块CD68、IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ的表达

小鼠主动脉组织包埋切片后，采用免疫组化染色两步法检测。60 ℃烤片2 h，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，PBS液冲洗3 次，3%双氧水孵育，血清封闭，一抗孵育过夜，二抗孵育，镜下观察。苏木素染液复染，中性树胶封片。每组均以PBS代替一抗作为阴性对照。于光学显微镜下观察切片，选取3个不同视野，采用IPP6.0图像分析软件进行分析，定量测定斑块内CD68、IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ阳性表达区域面积占斑块面积的百分比。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠血清hs-CRP水平的影响

与正常组相比，模型组小鼠主动脉根部斑块的脂质核心增大,纤维帽变薄，其血清hs-CRP水平显著升高。与模型组比较，四妙勇安汤组血清hs-CRP的水平显著降低(P<0.05)，辛伐他汀组显示降低趋势，但无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组对ApoE-/-小鼠血清hs-CRP水平的影响

2.2 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠主动脉斑块CD68表达的影响

正常组小鼠主动脉根部斑块无CD68表达，模型组CD68表达明显升高。与模型组比较，辛伐他汀组及四妙勇安汤组斑块局部CD68表达有降低趋势，但无明显统计学差异(P>0.05),见表2，图1。

表2 各组对ApoE-/-小鼠主动脉斑块CD68表达的影响

注：A.正常组；B.模型组；C.辛伐他汀组；D.四妙勇安汤组图1 各组ApoE-/-小鼠主动脉斑块CD68的免疫组化染色(×200)

2.3 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠主动脉斑块IL-1β表达的影响

正常组小鼠主动脉根部斑块无IL-1β表达，模型组IL-1β表达显示升高。与模型组比较，辛伐他汀组和四妙勇安汤组的斑块局部IL-1β表达有显著降低(P<0.05),见表3，图2。

表3 各组对ApoE-/-小鼠主动脉斑块IL-1β表达的影响

注：A.正常组；B.模型组；C.辛伐他汀组；D.四妙勇安汤组图2 各组ApoE-/-小鼠主动脉斑块IL-1β的免疫组化染色(×200)

2.4 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠主动脉斑块NF-κBp65表达的影响

正常组小鼠主动脉根部斑块未见NF-κBp65阳性颗粒表达，模型组的NF-κBp65阳性表达明显增加；与模型组比较，辛伐他汀组有降低趋势，但无明显统计学差异(P>0.05)，四妙勇安汤组NF-κBp65阳性表达有显著降低(P<0.05),见表4，图3。

表4 各组对ApoE-/-小鼠主动脉斑块NF-κBp65表达的影响

注：A.正常组；B.模型组；C.辛伐他汀组；D.四妙勇安汤组图3 各组ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块NF-κBp65的免疫组化染色(×200)

2.5 四妙勇安汤对ApoE-/-小鼠主动脉斑块PPAR-γ表达的影响

正常组小鼠主动脉根部斑块无PPAR-γ阳性表达，模型组的PPAR-γ阳性表达明显增加；与模型组比较，辛伐他汀组和四妙勇安汤组PPAR-γ阳性表达有增高趋势，但无明显统计学差异(P>0.05),见表5，图4。

表5 各组对ApoE-/-小鼠主动脉斑块PPAR-γ表达的影响

注：A.正常组；B.模型组；C.辛伐他汀组；D.四妙勇安汤组图4 各组ApoE-/-小鼠主动脉斑块PPAR-γ的免疫组化染色(×200)

3 讨论

中医以解毒活血法防治As已得到临床和基础研究的广泛认可[5]。研究表明解毒活血的方剂或单药能通过抗炎、抗凝、保护血管内皮、改善斑块内部成分等途径，延缓As发展，降低急性心脑血管事件的发生。四妙勇安汤是具有清热解毒、活血化瘀功效的经典方剂，方中以金银花为君，性味甘寒，直解热毒；玄参为臣，咸寒凉血，解毒散结；当归为佐，辛温通滞，活血化瘀；甘草为使，生以解毒，调和诸药；全方配伍严谨，疗效显著，成为国家中医药管理局首批确认的古代经典名方之一。同时现代科学对As斑块炎症研究的逐步深入，这有助于揭示四妙勇安汤的药理机制。研究表明单核细胞迁入斑块内成为泡沫细胞是斑块坏死脂质核心的重要组成部分，也是诱发As炎症反应的主要因素[6]。存在于巨噬细胞表面的清道夫受体CD68是目前最可靠的斑块内巨噬细胞标记物[7]，能与ox-LDL大量结合而促进巨噬源性泡沫细胞形成，并在一定程度上具有刺激巨噬细胞向M1型转化的作用[8]。然而单核细胞由血液迁入内膜，发挥吞噬作用并清除沉积于内膜的脂质和坏死物质的过程，是免疫系统保护血管的生理作用，故以抑制单核细胞迁入内皮的方法，并非理想的抗炎治疗策略[9]。通过抑制巨噬细胞的炎症反应，寻找有效的抗炎靶点和信号通路，成为了有效的As抗炎方案[10]。同时抑制炎症反应，在一定程度上能抵抗炎性衰老，恢复巨噬细胞的生理功能，进而促进As斑块的消退[11]。

血清hs-CRP水平是目前预测、诊断及风险评估As炎症反应程度最可靠的指标，亦常作为中医As之“毒”的生物学标志物，借以评价疗效的标准[12]。且CRP直接参与As的病理过程，其与配体结合后能够激活经典补体途径和通过招募H因子调节补体的旁路途径，促进As斑块炎症反应，导致不稳定斑块及血栓的形成[13]。在机制研究中，因CRP本身不能作为直接干预的靶点，调控其上游信号成为了降低CRP的主要方式[14]。目前“IL-1β/IL-6/CRP轴”是产生CRP的最主要途径，然而IL-6是一个二级信号因子，直接抑制是否具有特定的抗炎作用尚不明确，且存在载脂蛋白B及LDL-C增加的不利影响，暂未能成为可靠的研究靶点[15]。同时Meta分析也显示，抗炎治疗中IL-6上游的IL-1β是更为理想的靶标[16]。IL-1β不仅能有效抑制IL-6 信号，还具有不依赖IL-6，直接影响斑块炎症，诱发细胞凋亡的作用。CANTOS临床试验也证实抑制IL-1β能有效降低hs-CRP水平，减少心血管事件的发生，是有效的抗炎靶点[17]。对于IL-1β的调节，抑制NF-κB的激活是重要的途径[18]。研究表明通过激活IKK，诱发磷酸化IκB的泛素化，使得NF-κB活化，从细胞质转移至细胞核，并结合于DNA链上的特定序列而促进炎症因子IL-1β的基因转录[19]。同时国外研究已证实“NF-κB/IL-1β/CRP”是降低血清hs-CRP水平，防治As的有效通路[20]。而对于负反馈调节NF-κB信号途径，目前活化的 PPARγ是一种常见方式，其激动剂能通过竞争性抑制NF-κB，而减少IL-1β、TNF-α等炎因子表达，在免疫调节和抗炎中同样发挥着作用[21]。

本实验中，采用了高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠32周诱发As斑块炎症反应的经典模型，并以hs-CRP为研究靶点，对其上游可能的通路进行了初步的探究。研究显示模型组中血清hs-CRP水平及斑块局部CD68、IL-1β、NF-κBp65的表达均明显升高，表明As斑块中有大量巨噬细胞分化，炎症反应明显。与模型组比较，本实验中辛伐他汀及四妙勇安汤组均未能明显降低斑块CD68的表达(P>0.05)，表明对于减少斑块内巨噬细胞的迁入无明显作用，其抗炎效应以抑制炎症反应为主。相比于辛伐他汀的微弱抗炎效应(P>0.05)，四妙勇安汤能有效地降低血清hs-CRP水平(P<0.05)，具有更显著抑制As炎症的作用。在有效降低hs-CRP的基础上，本实验进一步探索了具体的抗炎分子机制，结果显示四妙勇安汤能有效抑制CRP上游的IL-1β、NF-κB炎症因子分泌(P<0.05)，但无明显激活PPARγ而抑制NF-κB的作用。可见四妙勇安汤是有效降低血清hs-CRP水平的药物，可通过抑制“NF-κB/IL-1β/CRP”通路实现，其效应机制不同于PPARγ激动剂。故在此研究的基础上，后期进一步明确四妙勇安汤特有的靶向抑制NF-κB而减少IL-1β、CRP分泌的通路、作用成分及独特抗炎效应，可避免全面抑制NF-κB 所带来的严重副作用。同时本实验能为临床开展四妙勇安汤以降低hs-CRP为靶点的抗炎治疗提供一定依据，也能为后期探究其降低hs-CRP的可能药理机制提供一定的参考。